外泌体作为脑靶向药物递送载体的研究进展

【综述】

由于血脑屏障的限制，将药物输送至大脑一直是治疗中枢神经系统疾病时面临的重大挑战。外泌体作为一种新型的天然药物递送载体，具有可以穿过血脑屏障的特性。因此，利用外泌体将药物安全、有效地递送至大脑将是治疗中枢神经系统疾病极具前景的新途径。

1 外泌体的功能特征      

外泌体是细胞分泌的一种膜性囊泡结构，粒径30~150 nm，可由几乎所有类型的细胞分泌。有证据表明，外泌体是细胞间通讯的关键参与者，既可通过表面配体直接接触和激活受体细胞，也可通过内吞作用将“货物”转移至受体细胞，发挥信号转导作用[1]。

目前，外泌体作为一种有前景的药物递送载体，得到广泛开发和研究。作为天然纳米囊泡，外泌体较其他传统药物递送系统具有以下显著优势：首先，外泌体具有较好的生物相容性、低免疫原性和低毒性，而人工合成的纳米载体（如聚乙二醇化纳米颗粒）在多次给药后可诱发机体免疫反应，导致其在体内被快速清除，并与过敏反应等不良事件相关[2]；其次，外泌体固有的“归巢”能力暗示了其在药物递送中的潜在效用，即借助特异性的膜表面受体或细胞外基质结合蛋白，不同细胞来源的外泌体可定向趋向性迁移，快速被特定的受体细胞识别、摄取并发挥作用；此外，外泌体为脂质小囊泡，能够有效地穿过包括细胞质膜、血脑屏障在内的主要生物屏障，这也是外泌体被用于中枢神经系统疾病治疗最为重要的优势[3]。 

2 外泌体——新型脑药物载体

2.1　外泌体通过血脑屏障实现脑药物递送

血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞、基底膜、周细胞和星形胶质细胞末端共同组成，将脑与包含炎症介质和免疫细胞的外周循环分隔开，以维持大脑稳态[4]。但这种特性也导致几乎所有的大分子药物以及98%以上的小分子药物不能透过血脑屏障，对药物研发和药物递送带来了巨大挑战[5]。而外泌体因其内源性、粒径小等优势，可透过血脑屏障，提高药物的跨血脑屏障递送效率。

2.1.1　天然外泌体穿过血脑屏障

外泌体具有基于亲本细胞的天然靶向能力，对特定类型的受体细胞有特异性。天然外泌体可以穿过血脑屏障，其机制主要与外泌体表面配体和脑血管内皮细胞表面受体之间的相互作用有关。Yuan等[6]发现，巨噬细胞来源的外泌体表面含有从其亲本细胞遗传的淋巴细胞功能相关抗原‑1，可与微血管内皮细胞表面的细胞间黏附分子‑1相互作用，从而穿过血脑屏障。与此类似，已证实未经任何修饰的血液来源外泌体也具有天然脑靶向能力，通过转铁蛋白和转铁蛋白受体的相互作用，成功地将多巴胺输送到脑[7]。

2.1.2　工程化外泌体穿过血脑屏障

尽管外泌体可以穿过血脑屏障，但经静脉注射的外泌体主要分布在肝或脾，脑内的分布相对较低。因此，很多研究利用现有手段对外泌体进行修饰，以增强其靶向脑组织的能力。Alvarez‑Erviti等[8]开创性地通过转导未成熟的小鼠树突状细胞使其表达外泌体膜蛋白（lysosome‑associated membrane glycoprotein 2b, Lamp2b）和神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein, RVG），处理后的细胞可产生富含RVG‑Lamp2b融合蛋白的外泌体。RVG‑Lamp2b通过与α7烟碱型乙酰胆碱受体结合使外泌体靶向脑。Ye等[9]将负载甲氨蝶呤的外泌体用凋亡诱导肽KLA和靶向肽LDL进行双修饰，用于胶质母细胞瘤的治疗。靶向肽LDL可与血脑屏障和胶质瘤细胞上高表达的LDL受体结合，从而促进外泌体穿过血脑屏障以及在肿瘤部位积累。

2.1.3　外泌体经鼻给药避开血脑屏障

鼻内给药是一种非侵入性药物输送方式，可避开血脑屏障，通过嗅神经或三叉神经通路直接将药物输送至大脑[10]。许多研究测试了外泌体经鼻给药后进入脑的可能性。Long等[11]研究证实，鼻内注射间充质干细胞来源的外泌体可到达小鼠海马，减轻癫痫持续状态模型小鼠的脑损伤，维持正常神经发生。尽管鼻内给药是一种可靠且很有前景的给药方式，但鼻腔容积、水解酶、黏液纤毛的清除等限制因素也会影响药物的转运和吸收，安全性和有效性有待进一步研究。

2.2　外泌体的药物装载方法

目前，将“货物”载入外泌体的方式主要有两种[12]：对亲本细胞进行修饰，使其分泌的外泌体载有功能分子；直接对分离提取到的外泌体进行修饰。

2.2.1　预负载——基于亲本细胞的修饰

最直接的方法是将药物与亲本细胞共同孵育，收集和纯化用于疾病治疗的外泌体。例如，将间充质干细胞与化疗药物紫杉醇共同孵育24 h，分离提取到包裹紫杉醇的外泌体，这种外泌体表现出显著的抗肿瘤增殖活性[13]。该方法主要适用于负载疏水性、小分子药物，且要求药物对亲本细胞的毒性不能太大，因此普适性不高。关于基因药物治疗，要使亲本细胞表达特定的小核酸分子，主要的方法是病毒转染技术。Lang等[14]用含miRNA‑24a的慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞，并从细胞上清液中分离得到过表达miRNA‑24a的外泌体。虽然基于亲本细胞的修饰方式可以间接实现外泌体的药物负载，但细胞内外泌体的生物发生过程比较复杂，这种方式载药效率较低且不容易控制。

2.2.2　后加工——对外泌体的直接修饰

相较之下，对外泌体进行直接修饰更加常见，可控性和装载效率相对更高。最简单的方法是将药物分子与外泌体共孵育，使药物被动地装载到外泌体中[15]。但是，简单的共孵育达到的装载效率并不令人满意。为了实现更高的装载效率，人们对电穿孔、超声、反复冻融、挤压、皂素透化等多种主动装载技术进行了广泛研究[16‑18]。不同的装载方法可达到不同的效率，而方法的选择往往取决于装载的药物类型。Haney等[19]比较了利用不同的方法将过氧化氢酶装载到单核细胞/巨噬细胞外泌体的效率，发现与反复冻融和常温孵育相比，超声处理和挤压可以获得更高的装载效率。 

3 外泌体在中枢神经系统疾病治疗中的应用     

目前已有大量研究将外泌体作为脑药物递送载体，利用动物和细胞模型评估不同细胞来源的天然或工程化外泌体对脑靶向药物递送的影响。

3.1　中枢神经系统退行性疾病

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的神经退行性疾病。由于血脑屏障的存在，多巴胺等治疗剂很难有效进入脑。目前，外泌体被广泛用于负载小分子、蛋白质和基因药物治疗PD。Qu等[7]成功利用血液来源的外泌体将多巴胺递送至大脑的纹状体和黑质。Cooper等[20]利用RVG修饰的外泌体实现了α‑突触核蛋白siRNAs向脑的递送，可有效减少α‑突触核蛋白的聚集，减少多巴胺能神经元的丧失，并显著改善PD小鼠的临床症状。

外泌体也被广泛用于阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）治疗的临床前研究。AD与β淀粉样蛋白的异常沉积和Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结有关[21]。Ding等[22]将间充质干细胞外泌体经尾静脉注射到AD小鼠体内，有助于清除β淀粉样蛋白沉积，修复认知功能障碍，并调节小鼠脑内小胶质细胞的活化，减轻神经炎症。

3.2　脑血管疾病

脑卒中是世界范围内最常见的死亡和致残原因之一，而由大脑动脉闭塞引起的缺血性脑卒中占80%以上[23]。目前，这类卒中的临床治疗受到治疗窗口狭窄和严重风险因素的限制。Tian等[24]利用环（Arg‑Gly‑Asp‑D‑Tyr‑Lys）肽［c（RGDyK）］修饰的骨髓间充质干细胞外泌体负载姜黄素，经静脉注射后外泌体可到达短暂性大脑中动脉闭塞模型小鼠脑损伤区域，有效抑制炎症反应和细胞凋亡。Song等[25]证明，M2型小胶质细胞外泌体可减少神经元凋亡并促进神经功能恢复，其机制与上调的miR‑124有关。

3.3　脑肿瘤

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，具有高侵袭性和高死亡率的特点。Murgoci等[26]证实，小胶质细胞来源的外泌体以时间依赖的方式抑制肿瘤侵袭，提示了其作为脑胶质瘤纳米治疗剂的潜力。Kim等[27]将过表达miR‑584‑5p的骨髓间充质干细胞外泌体与胶质母细胞瘤U87细胞体外共同孵育，发现U87凋亡增加，增殖和迁移能力减弱。

3.4　其他脑部疾病

多发性硬化是一种发生于中枢神经系统的炎症性脱髓鞘疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎模型是研究该疾病的基本模型。有研究证实，静脉注射由γ干扰素刺激的骨髓间充质干细胞外泌体后，对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠有良好的治疗效果，相关机制与抑制病理性T细胞和诱导调节性T细胞活化相关[28]。

创伤性脑损伤是一个严重的公共卫生问题，除了造成弥漫性轴索损伤、脑挫裂伤以及脑出血等原发性损伤，还涉及神经炎症反应、氧化应激和细胞凋亡[29]。Long等[30]发现富含miR‑873a‑5p的星形胶质细胞外泌体可促进小胶质细胞的M2型转化，通过抑制NF‑κB信号通路减轻神经炎症，改善创伤性脑损伤小鼠神经功能缺损。 

4 总结与展望      

药物向脑的靶向递送一直是治疗中枢神经系统疾病急需解决的关键问题之一。外泌体的发现为药物进入并在中枢神经系统中转运开辟了新的途径。然而，基于外泌体的脑靶向药物递送技术尚存在许多重要问题需要解决。目前我们仍不清楚外周给予外泌体是如何进入大脑并将“货物”递送至中枢神经系统，这一机制的阐明将为外泌体介导脑靶向药物递送技术的开发应用和中枢神经系统的疾病治疗奠定科学基础。此外，外泌体的纯度、产业化生产、载药效率和稳定性等都是将外泌体靶向药物递送技术应用于临床实践的重要考量。如何解决上述问题，促进基于纳米载体的药物递送从实验室到临床应用的有效转化，需要更系统完善的研究总结及多学科更紧密的合作和交流。

主管：中华人民共和国  国家卫生健康委员会

主办：中华医学会   徐州医科大学

张馨月董贝贝 蒋毅 于泳浩

天津医科大学总医院麻醉科，天津市麻醉学研究所，天津 300052

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(7):781-784.