【话险危夷】体外膜肺氧合(ECMO)期间凝血过程的激活

2022-08-22 09:44 古麻今醉

体外膜肺氧合（ECMO）是挽救生命的重要措施，但在辅助期间会发生氧合器、管路附壁血栓、溶血和血管相关血栓的风险。

摘要：

体外膜肺氧合（ECMO）是挽救生命的重要措施，但辅助期间会发生回路血栓、氧合器栓塞、溶血和全身血管血栓的风险。凝血酶的形成是血栓形成的关键步骤，维持凝血酶的稳定需要凝血酶原的激活和促凝磷脂。

材料和方法：

本研究的目的是利用凝血酶生成电位（TGP）和其他测定方法，确定ECMO患者血浆中的细胞促凝磷脂的来源和特异的凝血激活因子。从60名ECMO患者（年龄1-19岁）中收集样本，并对其进行生理和干预性的TGP检测，通过流式细胞术测定因子II的水平和促凝剂细胞外囊泡的水平。

结果：

在ECMO期间，未刺激的TGP增加，ECMO撤机后下降，并恢复正常。ECMO血浆中TGP的主要激活因子是FXIa，FXIa到达7%时组织因子活性增加出现。ECMO患者血浆中促凝磷脂以血小板和红细胞胞外囊泡的形式出现。促凝细胞外囊泡水平与血浆天然TGP活性增加相关。

结论：

ECMO主要通过接触并激活因子XIa的形成以及通过血小板生成促凝细胞外囊泡来激活血浆中的凝血系统。

1.导言

体外膜肺氧合（ECMO）挽救生命重要手段之一，但仍会伴随许多并发症，包括出血以及ECMO回路中血栓形成[1,2]。回路中血栓的形成增加了氧合器内栓塞、机体动脉血栓，溶血的风险[3]。凝血酶的产生是止血的关键步骤。在正常情况下，凝血酶仅在伤口部位合成，它产生了凝血机制的瀑布效应。凝血酶是血小板、纤维蛋白原和凝血因子V、VIII、XI、XIII的有效激活剂。然而，凝血酶的产生也受到严格控制。一旦出血停止，伤口闭合，凝血酶的进一步生成就会被包括抗凝血酶、蛋白C/S和组织因子在内的调节系统阻断。

凝血酶的持续产生需要两个因素，一个是促进凝血激活因子的启动，另一个与促进凝血的磷脂结合。在正常情况下，血管周围的组织因子作为凝血激活因子，激活血小板与血管内皮下的胶原结合，而血管性血友病因子提供磷脂吸附表面。在ECMO回路中，没有组织因子及血管内皮的胶原。那么，在ECMO回路中如何激活凝血酶？

人工材料的体外研究通过使用动物和人类血液模拟ECMO管路，证明了ECMO管路材料能激活凝血系统、血小板和单核细胞[4-10]。在体研究表明，ECMO管路材料可以激活血小板、白细胞、内皮细胞以及补体，免疫系统，凝血系统。但在ECMO管路中凝血酶原是如何被持续刺激而导致血栓形成的[11-18]？

通过确定体内血浆产生凝血酶的过程从而了解凝血功能的方法，称为凝血酶生成电位（TGP）或内源性凝血酶电位（ETP）[19]。TGP分析已用于评估凝血系统，是测定出血和血栓形成研究领域的一个重要研究工具[20]。可以通过多种分析方法进行检测[21,22]。首先，可以简单地对样品进行分析，血浆中只加入钙离子以允许任何凝血活化因子和磷脂使凝血酶原转化为凝血酶。这被称为生理（天然）TGP。在健康受试者中，除非存在伤口，否则不会激活凝血系统，因此，在生理TGP测定期间没有凝血酶的产生[21]。生理TGP实验表明严重创伤导致血液中凝血激活因子的释放导致高水平的生理TGP[22]。第二种TGP测定方法是，加入已知量的组织因子和磷脂然后测量凝血酶生成。这种类型的TGP测定法测定患者血浆对已知的刺激的反应，类似于被伤口激活的凝血系统[23]。

本研究的目的是使用TGP和其他测定方法来确定ECMO患者血浆中的特异性凝血激活因子和凝血相关磷脂的来源。每天从接受ECMO的患者血液样本中收集数据，并对其进行两种TGP检测方法，检测因子II水平和促凝剂细胞外囊泡（EV）水平。

2.材料和方法

2.1 人体受试者

本研究已获得西雅图儿童医院人体受试者机构审查委员会的批准。在患者接受ECMO治疗的每一天，尽可能收集同意样本和剩余样本(放弃同意)。参考范围基于28名健康成年人的单一样本。对样本进行抗凝处理，9份血液中加入1份0.105 mol/L（3.2%）柠檬酸三钠溶液，2000g离心15min，去除血浆后2000g重新离心15min。储存于-80℃冰箱。使用两种ECMO回路类型，Maquet Quadrox氧合器与Sorin Revolution离心泵（肝素涂层氧合器和磷脂酰胆碱涂层管道，N=27）和管路集成泵/氧合器的Cardiohelp 7.0（肝素涂层氧合器和管道，N=36）。ECMO抗凝的标准方法：在插管时静脉推注75U/kg的肝素，然后以20U/kg/h的速度进行肝素输注，最终调整为目标抗Xa肝素活性范围（0.2至0.4U/mL）。

2.2.凝血酶生成

凝血酶敏感的荧光底物有Z-Gly-Gly-Arg-AMC、TGA试剂C high、凝血酶活性标准品、肝素酶、抗人组织因子（4509）、膜联蛋白V、抗人因子XI（抑制性，AHXI-5061）。在生理或组织因子刺激条件下，对解冻血浆样品进行一式两份凝血酶生成电位（TGP）测定。测定TGP前，所有样本均使用肝素酶处理。生理（未受刺激）的TGP：将40μL柠檬酸盐抗凝血浆加入10μL凝血酶生成缓冲液（20mmol/L HEPES、140mmol/L NaCl、5mg/mL牛血清白蛋白、0.02%叠氮化钠、400μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂，pH 7.35）。为了防止天然凝血酶生成测定过程中被测定板中的塑料接触激活，向分析缓冲液中添加玉米胰蛋白酶抑制剂，以在分析中达到40μg/mL的最终浓度。组织因子刺激的TGP：将40μL柠檬酸盐抗凝血浆加入10μL TGA试剂C（含有组织因子和促凝血磷脂）。当在刺激凝血酶生成试验期间添加高浓度的组织因子和磷脂时，试验板的接触激活被压制，无需使用玉米胰蛋白酶抑制剂。血浆和试剂加热至37℃。反应开始时，在试剂/血浆混合物中加入50 μL钙/荧光底物试剂(最终测定浓度为7.5 mmol/L钙和0.5 mmol/L底物)。使用 Synergy HT 酶标仪（ 360 nm 激发波长和 460 nm 发射波长)在 37℃下进行荧光监测，时间90min，间隔时间1min。如前所述，如前所述，测量的荧光单位被校正为内部过滤器效应和底物耗尽，活性凝血酶浓度被校正为反应过程中形成的残留凝血酶-α2-巨球蛋白复合物。

峰值 TGP 定义为 90 min监测期间的最高活性凝血酶浓度。总TGP由曲线下面积估算，定义为1 ~ 90 min凝血酶浓度之和(nmol/L·min)。为了进一步评估天然（未受刺激）的TGP，我们抑制组织因子活性，在10μL凝血酶生成缓冲液（对照）、抗TF抗体（100μg/mL）、抗XI因子抗体（100μg/mL）或膜联蛋白V（100μg/mL）中加入40μL血浆，室温下孵育5min。

2.3. 流式细胞术

使用藻红蛋白（PE）标记膜联蛋白V、使用PE-Cy5标记抗人CD41a、使用PE-Cy5标记抗人CD235a。Phe-pro-arg氯甲基酮（PPACK）。如前所述，使用Apogee A60流式细胞仪处理样本。使用 CD41 抗体鉴定血小板 EV (PEV)，而使用抗血型糖蛋白 A (CD235a) 抗体鉴定红细胞 EV (REV)。EV尺寸检测下限约为100 ~ 200 nm。所有抗体、缓冲液和流式细胞仪鞘液经0.1μm过滤。通过向15μL无血小板血浆中加入3.6μL抗CD41a-PECy5、1.8μL膜联蛋白PE和9.6μL HEPES稀释缓冲液（10mmol/L HEPES、140mmol/L NaCl、4.5mmol/L KCl、pH 7.4）对PEV进行染色，室温下避光保存30分钟，通过向15μL无血小板血浆中添加2.0μL抗D235A-PECy5、1.8μL膜联蛋白PE和11.2μL HEPES稀释缓冲液对REV进行染色，室温下避光保存30min。加入12.5mmol/L钙的HEPES缓冲液将血小板和红细胞EV样本稀释至1:40-1:120后，室温下进一步保存30min，以促进膜联蛋白结合，加入15μmol/L PPACK防止钙化稀释血浆发生凝血。在含有EDTA的HEPES缓冲液中稀释annexin-PE空白液，并用于所有样本上。将特异性单克隆抗体替换为具有适当荧光偶联物的小鼠IgG，以评估非特异性结合。EV 事件最初由血小板 EV 的膜联蛋白-PE 或 CD41-PECy5 荧光和红细胞 EV 的膜联蛋白-PE 或 CD235a-PECy5 荧光触发。血小板EV事件被设定为CD41+annexin V+(PEV1)或CD41+annexin V-(PEV2)事件。红细胞EV事件被设定为CD235a+annexin V+(REV1)或CD235a+ annexin V-(PEV2)事件。

2.4.统计

取每位患者数据平均值，用于确定总体组分布，以2.5%至97.5%的百分比作为中位数。使用Mann-Whiney检验评估各组之间的差异（除外另有说明）。使用对数转换EV数据的线性回归评估EV相关性。

3.结果

3.1 ECMO期间凝血酶激活能力

研究中 60 名患者的人口统计资料如表 1 所示。中位年龄为 2 周，ECMO辅助最常见的原因是呼吸衰竭的21 名患者 (35%)，其次先天性心脏病17 名患者 (28%)。共进行63 次 ECMO辅助治疗，辅助时间中位数为 6 天，范围为1至41天。总体而言，50名患者在 ECMO 中存活，10名患者死亡。图1显示了正常受试者和ECMO患者中的TGP示例。两者都显示了血浆中的凝血酶是在重钙化和组织因子及磷脂的刺激下形成的（刺激的TGP）。在正常受试者中，如果只进行重钙化，不进行刺激，则TGP较低或不存在（天然 TGP）。与此相反，ECMO患者的生理TGP升高，通常相当于刺激的TGP水平，这表明ECMO诱导了血浆中的凝血激活，可以在TGP检测中仅使用重钙化法来检测。ECMO患者的刺激性TGP水平正常（表2，图2），但生理TGP升高。生理TGP与刺激TGP之比（N/S比）是衡量ECMO样本中凝血功能增强的一个有效指标。总的来说，ECMO期间，中位峰值和总N/S比值增加（P < 0.0001）。TGP在接受 ECMO 治疗的儿科患者中差异很大，少数患儿显示正常水平，少数患儿显示高水平的TGP。在ECMO辅助的第一个24小时内，N/S比值的峰值和总比值高于其余时间（TGP峰值，P<0.032，TGP总比值P<0.007）。

ECMO患者的中位因子II水平低于参考范围。ECMO患者的刺激性TGP与因子II水平的比值增加，表明ECMO 患者在血液中凝血酶原水平给定的情况下，比正常患者制造更多的凝血酶。随着ECMO患者病情的改善，他们的因子II水平趋于上升，刺激性PTG与因子II的比率下降。

与先天性心脏病患者相比，有呼吸系统病史患者的TGP峰值和总刺激及因子II的中位数较低（P<0.16），但这可能是由于呼吸道疾病患者的因子II水平呈上升趋势（P=0.08）。使用Maquet Quadrox氧合器和Sorin Revolution离心泵的ECMO患者与使用的Cardiohelp 7.0氧合器相比，显示出更高的峰值和总N/S TGP比率（中位数75% vs 58%，P < 0.005）。V-A ECMO与V-V ECMO的患者的TGP没有差异。其他患者群体太小，无法进行有意义的统计比较。

图1.正常受试者和ECMO患者中凝血酶生成电位（TGP）的示例。实心曲线显示了组织因子和促凝磷脂（刺激TGP）刺激的顽固性血浆的凝血酶生成。虚线显示血浆仅重钙化时产生凝血酶（天然TGP）。在正常受试者中，天然TGP测定过程中很少或没有产生凝血酶。在ECMO患者中，天然TGP与刺激TGP相似。ECMO患者图中的虚线是添加抗因子FXI抗体后的天然TGP，该抗体抑制了90%以上的天然凝血酶生成，表明ECMO诱导接触激活，进而刺激血浆中的凝血酶产生。

V-A ECMO与V-V ECMO其他患者群体太小，无法进行有意义的统计比较。

中位数（2.5%至97.5%百分位数）。ECMO=体外膜肺氧合，TGP=凝血酶生成潜力*P基于Mann-Whitney非配对非参数检验。

图2 体外膜氧合（ECMO）每天产生凝血酶的可能性。中值=填充圆和线，2.5%至97.5%的百分位=上下误差线。TGP=凝血酶生成潜能。

3.2. ECMO前和ECMO后的TGP

两名患者在ECMO辅助前留取样本。与ECMO开始后不久采集的样本相比，两者均显示在ECMO时的N/S TGP峰值比值增加（一名患者在ECMO前为42%，在ECMO时为111%，另一名患者为33%至52%），表明ECMO辅助时凝血功能会在早期激活。10名患者在脱离ECMO后即刻留取样本。一般来说，N/S TGP峰值比值从ECMO辅助时的63%±22%下降到ECMO撤机后的31%±16%（P=0.01，配对t检验），表明ECMO撤机后凝血功能的激活有所下降。

3.3.抑制剂研究

在14次ECMO辅助中，对13名患者的样本进行了组织因子活性、XI 因子活性和促凝血磷脂（使用膜联蛋白 V）的抑制的测定。所有测试的患者均显示膜联蛋白 V 几乎完全抑制了天然凝血酶生成潜力（98%±2%的TGP峰值抑制，98%±0%的TGP总抑制）。在所有测试的患者中，抗因子 XI 强烈抑制天然凝血酶生成潜力（89%±13%的TGP峰值平均抑制，87%±15%的TGP总抑制）。抗组织因子在14次测试中，13次对原生凝血酶生成能力基本没有影响（4%±5%平均抑制TGP峰值，3%±5%抑制TGP总量）。一位患者表现出抗组织因子对天然凝血酶生成潜力的抑制（65%的TGP峰值抑制，84%的TGP总抑制）。

3.4. TGP与细胞外囊泡水平的关系

ECMO 患者的血小板和红细胞胞外囊泡水平升高（表3），表明 ECMO 期间发生了血小板和红细胞活化或损伤。生理TGP与增加的血小板和红细胞胞外囊泡水平相关。N/S 峰值比与血小板细胞外囊泡水平 (r2 = 0.45) 或表达促凝血磷脂的红细胞胞外囊泡 (REV1, r2= 0.64, 图 3) 之间的相关性最强。

有呼吸系统病史的患者与先天性心脏病患者的血小板或红细胞胞外囊泡水平没有差异， V-A ECMO与V-V ECMO的患者的血小板或红细胞外囊泡水平没有差异。使用Maquet Quadrox氧合器与Sorin Revolution回路的ECMO患者与使用Cardiohelp 7.0集成泵回路相比，显示出与血小板和红细胞活化相关的更高的促凝血小板和红细胞胞外囊泡水平（PEV1 中位数为 101,000/μL 与60,000/μL， P = 0.0007；REV1 中位数 95,000/μL 与 56,000/μL， P = 0.002）。与血小板和红细胞损伤有关的血小板和红细胞胞外囊水平（PEV2和REV2）在两种类型的回路之间没有差异。其他患者群体太小，无法进行有意义的统计比较。

图3.天然与刺激峰值凝血酶生成电位（TGP）比率与血小板或红细胞胞外小泡水平之间的相关性。

4.讨论

凝血功能的启动需要两个因素：1) 凝血系统的启动因子 2) 聚集激活的凝血因子的促凝血磷脂表面。在正常情况下，凝血仅发生在伤口部位，直到血液与伤口中的组织因子和胶原蛋白接触后，凝血才被激活。组织因子启动凝血激活，而血小板通过血管性血友病因子与暴露的胶原蛋白结合。

凝血酶的生成加速了凝血和血小板的激活。一旦伤口被堵塞，抗凝血酶、蛋白质C/S和组织因子通路抑制剂等抗凝血系统会减缓凝血酶的生成，以防止血栓的进一步生长和血管的闭塞。因缺乏接触启动因子前激肽释放酶、高分子量激肽原和因子XII，故正常患者不会出血。因此，对于伤口，血管周围的组织因子是主要的凝血激活剂，而与伤口部位结合的活化血小板提供促凝血剂磷脂。

凝血酶生成潜力的测定可用于评估基于患者凝血系统变化的出血和血栓风险。TGP在有静脉血栓栓塞史以及与高凝状态和血栓形成风险增加相关的疾病中会增加。TGP的升高对中心静脉导管血栓形成有预测作用。TGP可用于评估与血栓风险相关的凝血系统的变化。患有急性淋巴细胞白血病的儿童表现出 TGP 升高与细胞游离DNA水平升高有关，细胞游离DNA是炎症细胞的一种成分。在脑膜炎球菌败血症休克的小儿患者中，TGP的升高与血浆中脂多糖和细胞外囊泡相关组织因子水平的升高有关。在患有肾病综合征（一种易栓疾病）的儿童中，TGP的升高与疾病严重程度的标志物有关。

在使用ECMO辅助的儿童患者中，血栓形成风险的增加可能与患儿的基础疾病和ECMO回路本身有关。TGP可以帮助预测血栓形成的风险和潜在机制。临床研究表明，ECMO期间凝血功能的激活首先导致纤维蛋白、血小板和白细胞在管路表面沉积，在一些患者中可发展为大面积血栓。人工材料的体外研究和使用动物和人类血液模拟ECMO回路的体外研究表明，ECMO回路材料能够激活血小板和单核细胞。在这项研究中，我们使用生理和刺激的 TGP扩大了对儿童ECMO期间凝血功能激活的理解，并在基于血浆的检测中确定促凝血磷脂、组织因子的作用。

我们发现，在ECMO辅助开始后，血小板和红细胞立即被激活，这反过来又通过生成因子XIa和释放血小板和红细胞的促凝血细胞外囊泡来激活凝血。这可以通过天然（未受刺激）TGP的增加来证明，可被因子XIa的抗体和用膜联蛋白 V阻断促凝血磷脂所抑制。血浆组织因子的活性只在大约7%的ECMO辅助患者样本中增加，而因子XIa的活性在所有测试的ECMO样本中都增加。先前的工作表明，循环单核细胞可以被ECMO激活并表达组织因子，所以ECMO血液中可能存在组织因子的细胞来源。

之前的研究报告称，血小板和红细胞被ECMO回路激活，导致细胞外囊泡的释放。我们发现，ECMO患者的血浆中存在促凝血磷脂，其形式为血液中血小板和红细胞细胞外囊泡，与正常受试者相比增加了2至7倍。促凝血细胞外囊泡水平与血浆中生理TGP活性（N/S比值）相关。TGP在ECMO辅助的第一个24小时内是最高的，这与之前的研究是一致的，即在第一个24 小时内补体和血小板的早期激活，随后几天凝血酶和D-二聚体的形成逐渐增加。一项成人 ECMO 研究显示，与其他凝血因子相比XI因子较低，这与XI因子的激活和消耗一致，研究显示接触因子XIIa被抑制时凝血激活减少，如最近狒狒ECMO模型。

TGP与血液中的因子II（凝血酶原）水平呈线性关系，因为因子II是凝血酶生成的最终底物。健康的新生儿、婴儿和幼儿的TGP刺激水平低于成人，部分原因是包括因子II在内的维生素K依赖性凝血因子水平降低。在小儿ECMO期间，受刺激的TGP与因子II的比率增加，表明由于循环中激活剂和磷脂的增加，ECMO 患者在血液中凝血酶原水平一定的情况下，比正常患者拥有更多的凝血酶。随着ECMO患者病情的改善，他们的因子II水平趋于上升，刺激PTG与因子II的比率下降。

儿童患者对ECMO的凝血反应表现出相当大的差异性。一些患者的TGP和细胞外囊泡水平正常，表明几乎没有发生凝血激活，而另一些患者的TGP和细胞外囊泡水平增加了10倍以上（图2）。之前的研究发现，合并基础疾病、管路和血流动力参数相似的患者对ECMO的反应非常不同，这表明患者对回路反应的遗传变异在ECMO的凝血激活程度起作用。患者的基础条件很可能也起了作用。

我们发现，由于先天性心脏病而进行ECMO辅助的病人比呼吸衰竭的病人显示出更高的刺激性TGP/因子II。其他患者群体量太小，无法进行有意义的比较。管路类型及配置也有可能影响ECMO期间的凝血功能。使用Maquet Quadrox氧合器和Sorin Revolution离心泵的ECMO患者与使用集成泵/氧合器的Cardiohelp 7.0相比，TGP增加，血小板和红细胞胞外囊泡活化水平更高，这表明Maquet系统与Cardiohelp系统相比，前者的管路表面差异更能激活血小板和红细胞。V-A ECMO与V-V ECMO 在TGP、血小板或红细胞激活方面没有显示出差异。

总体而言，这表明血液暴露在ECMO回路中会导致患者的接触系统、血小板和红细胞的激活，从而通过因子 XI 激活凝血系统，而促凝血细胞外囊泡的释放为加速凝血激活提供了表面。这种激活主要发生在ECMO回路表面，所以凝血酶的生成在人工表面最高，导致纤维蛋白的生成和沉积，并进一步导致血小板的激活和沉积。在大约80%的病例中，纤维蛋白和血小板沉积在回路中，随后在回路中形成肉眼可见的血栓，并伴有动脉栓塞、溶血和回路故障的风险。患者的血栓形成并不常见，因为大多数儿科患者在ECMO期间使用肝素或直接凝血酶抑制剂进行抗凝。

本研究的局限性包括只对基于血浆的凝血激活物质进行评估，只对儿童（新生儿到青少年）进行评估，以及使用成人参考范围组。未来的研究需要更好地了解个别病人的遗传学和病人的基本情况对ECMO期间凝血功能激活的影响。

评述：

体外膜肺氧合（ECMO）是挽救生命的重要措施，但在辅助期间会发生氧合器、管路附壁血栓、溶血和血管相关血栓的风险。凝血酶的形成是血栓形成的关键步骤，维持凝血酶的稳定需要凝血酶原的激活和促凝磷脂。本研究从60名ECMO患者（年龄1-19岁）中收集样本，利用凝血酶生成电位（TGP）等方法，确定其血浆中的细胞促凝磷脂的来源和特异的凝血激活因子。作者发现在ECMO辅助期间，未刺激的TGP增加，ECMO撤机后TGP下降，随后恢复正常。ECMO主要通过接触并激活因子XIa的形成以及通过血小板生成促凝细胞外囊泡来激活血浆中的凝血系统。但儿童患者对ECMO的凝血反应表现出相当大的差异性：一些患儿的TGP和细胞外囊泡水平未见明显异常，表明几乎没有发生凝血系统激活；而另一些患儿的TGP和细胞外囊泡水平增加了10倍以上。本研究仍存在一定的局限性，包括只对基于血浆的凝血激活物质进行评估，只对儿童（新生儿到青少年）进行评估，以及使用成人参考范围组。今后的研究需要更好地了解病人的遗传学基本情况对ECMO期间凝血功能激活的影响。未来有必要开展更多基础及临床研究，深入探索相关机制，积累更多证据指导临床实践。

翻译：吴丽、朱倩倩

校对：张雯

点评：石文剑

原始文献：Coagulation activation during extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) . Wayne L. Chandler . Thrombosis Research 2022 ; 211:154–160

主编：徐桂萍肖东苏涛

（仅供医学专业人士参考）

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