【醉翁之艺】年轻小鼠的脑脊液通过Fgf17恢复老年小鼠少突胶质细胞生成和记忆功能

    以往研究表明，年轻小鼠的血液可以改善老年小鼠的记忆功能。于是人们针对全身系统环境可以塑造大脑的理解，制定出许多减缓大脑老化的干预策略。脑脊液（   Cerebrospinal fluid   ，   CSF   ）是构成脑细胞的直接环境，为脑细胞提供营养成分   。   少突胶质细胞是中枢神经系统起源、分化和功能脱髓鞘疾病中一类重要的髓鞘生成细胞。  

脑脊液与脑细胞密切相关，携带神经祖细胞在发育过程中增殖和分化的信号。然而，脑脊液蛋白质组成随着人的年龄而变化，表现为炎症蛋白的增加和生长因子的减少。但脑脊液的这些变化是否会导致年龄相关的认知能力下降尚不清楚。为此，来自斯坦福大学医学院的研究人员针对海马及少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte progenitor cell，OPC）和脑脊液进行研究，结果于2022年5月发表在Nature 期刊上。

1. 年轻小鼠脑脊液能够调节少突胶质细胞的树突发生

图1    年轻   小鼠   CSF   改善记忆巩固，促进   OPC   增殖和分化    

条件恐惧实验结果发现，年轻小鼠CSF改善了老年小鼠的记忆功能，海马体转录组分析显示，少突胶质细胞对年轻小鼠CSF环境最敏感，且年轻CSF能够促进老年小鼠海马体OPC的增殖和分化。  20月龄小鼠接受3次足部电击，然后随机分为两组，分别注入人工脑脊液（artificial CSF，aCSF）或年轻小鼠脑脊液（YM-CSF）1周，并在3周后测试远期记忆能力。注射YM-CSF后，暴露于音调和光线下的平均僵直时间更长，表明具有更强的远期恐惧记忆（图1b）。通过RNA测序技术评估输注年轻CSF对海马转录组的影响，发现两组间存在271个差异表达基因，且少突胶质细胞基因表达高度上调（图1a-b），驱动少突胶质细胞分化和主要髓鞘蛋白成分（图1d）。年轻CSF使海马CA1区增殖OPC的百分比增加2.35倍，但在皮质中没有增加（图1e-f）。 在另一组实验中，向老年小鼠输注健康年轻人类（YH-CSF）或老年人类（AH-CSF）CSF。YH-CSF诱导OPC增殖的水平与YM-CSF相当，而AH-CSF诱导增殖的细胞数量只有YM-CSF的一半。增殖细胞成熟3周后，通过MBP染色和透射电镜评估年轻CSF对海马髓鞘形成的影响。发现海马MBP强度（图1i-j）和有髓轴突数量（图1k）增加，表明年轻CSF含有促进少突胶质细胞系细胞生长的信号或中和抑制因子的物质。通过剥夺OPC有丝分裂原以促进细胞分化超过4天，YH-CSF不仅诱导细胞存活率显著增加，而且还促进分化程度更高的成熟细胞形态显著扩大，每个细胞的MBP强度总体增加（图1n-o）。这些结果与之前的研究一致，即来自年轻健康捐赠者的人CSF被证明能够诱导神经元活性，而来自多发性硬化患者的CSF对神经元和OPC培养物具有毒性。  

2.   SRF介导年轻CSF对OPC的影响  

图2   SRF   由年轻   CSF   诱导，并介导   CSF   诱导的   OPC   增殖  

图   3   老年小鼠   海马   OPC   中的   SRF   信号下调，   可   通过   注射年轻   CSF   诱导增加    

为了进一步明确机制，研究者对年轻小鼠CSF激活的信号转导通路进行探索。通过 RNA 代谢测序，发现血清反应因子（Serum response factor，SRF）能够介导年轻小鼠CSF对少突胶质前体细胞的促增殖作用。

使用硫醇（SH）连接烷基化方法，采用4-硫尿苷（s4U）标记新生mRNA，对暴露于YH-CSF 1或6小时的OPC的RNA进行代谢测序。发现1小时后SRF显著升高，SRF与血清反应元件（Serum response element，SRE）启动子序列结合，通过调节即刻早期基因（如Egr1）和肌动蛋白细胞骨架来诱导细胞运动、增殖和分化。进一步研究发现，暴露于YH-CSF 6小时的OPC细胞表达的鬼笔环肽（phalloidin）是对照组的两倍（图2d-e），在注射YM-CSF 6天的老龄小鼠海马OPC中，也发现了鬼笔环肽强度的增加（图2f-g）。

肌肉细胞中特定SRF信号的缺失导致小鼠骨骼肌加速老化。因此，研究者进一步探索SRF信号是否在老龄大脑OPC中下调。通过原位杂交实验发现，海马CA1区SRF阳性OPC的比例随年龄显著下降（图3a-b），并根据表达编码年轻（3月龄）和老年（25月龄）小鼠少突胶质细胞转录因子Olig2的基因对海马OPC和成熟少突胶质细胞的细胞核进行了分类，并进行了RNA序列分析。OPC中随着年龄增长而下调的富集通路与少突胶质细胞标记物、神经胶质细胞分化的调节、细胞呼吸和代谢以及蛋白质折叠有关。相反，免疫相关途径和小胶质细胞特异性基因随着年龄的增长而上调（图3c-d）。

接着，研究者设计了一种急性注射模型，将CSF注射到18月龄小鼠的侧脑室，并在注射OPC和OL核的RNA序列后1和6小时取对侧海马，发现预测的SRF靶点的基因在OPC中两个时间点均上调（图3e）。在6小时，OPC中上调的基因与SRF相关途径有关（图3f）。总之，这些实验表明OPC中的SRF信号随着年龄的增长而下调，并在体内急性注射年轻CSF后诱导增加。

3.    Fgf17模拟脑脊液对OPC和记忆的影响  

图4   Fgf17   诱导   OPC   增殖并改善记忆  

研究者筛选了CSF中潜在的 SRF 激活剂，发现成纤维细胞生长因子17（Fibroblast growth factor 17，Fgf17）是诱导 SRF 信号转导的候选分子。Fgf17 在老年小鼠中的表达水平降低，输注 Fgf17 能够诱导老年小鼠的少突胶质前体细胞增殖和记忆能力改善，阻断 Fgf17 则会损害年轻小鼠的认知能力。  

研究者将两个已发表的CSF蛋白质组学数据集与TRANSFAC预测的SRF靶点列表进行交叉引用，生成了35个潜在SRF诱导物。为了测试这些候选基因的活性，用SRE-GFP报告基因转染HEK293细胞，并添加不同浓度的蛋白质（图4a），发现Fgf8和Fgf17诱导最强的剂量依赖性反应（图4b-d）。研究者选择Fgf17进一步探索，因其是一种大脑富含的蛋白质，在人类脑脊液（图4e）、人类血浆以及小鼠神经元中的水平随着年龄的增长而降低（图4f-g）。  

进一步探索机制，研究者分别使用Jasplakinolide和Latrunculin A增强和抑制肌动蛋白聚合，发现Fgf17通过肌动蛋白调制激活SRF信号，表明Fgf17通过Rho-GTPase激活和肌动蛋白动态调节激活SRF途径。当添加到原代大鼠OPC中时，Fgf17诱导OPC增殖（图4h-i）和分化（图4j-k）。为了确定体内活性，将重组Fgf8和Fgf17注射到老龄小鼠体内7天以上，发现Fgf17诱导老年海马OPC增殖，但Fgf8没有（图4l-m）。  

研究者进一步测试了注射Fgf17对认知的影响，发现其能够改善长期记忆（图4n）。这些实验表明，Fgf17能够模拟年轻脑脊液对海马OPC和老年小鼠记忆巩固的影响。最后，向年轻小鼠注射抗Fgf17阻断抗体ICV，测试Fgf17是否是正常记忆功能所必需的。注射抗Fgf17抗体的小鼠在两种海马依赖性认知测试（Y迷宫和情境恐惧条件反射）中表现为记忆受损（图4o-p），并且存在神经元可塑性受损（图4q-r）。综上所述，这些实验在年轻和老年小鼠中提供了Fgf17和认知功能之间的关键联系。  

醉翁之艺 点评

本研究发现，年轻小鼠CSF能够改善老年小鼠的记忆功能，这与OPC增殖和海马髓鞘形成增加有关。Fgf17在小鼠神经元和人类脑脊液中的水平随着年龄的增长而降低，这对于提高老年小鼠的认知能力和促进OPC在体内外的增殖是非常关键的。年轻CSF诱导转录因子SRF及其肌动蛋白细胞骨架靶基因的表达，促进OPC增殖。SRF是神经元发育和活性依赖性可塑性的多功能调节因子，在OPC中广泛表达，并随着年龄的增长而下调。SRF协调了各种细胞类型的可塑性，并且随着年龄的增长，其丢失会促进神经退行性变。  

将Fgf17注入老年小鼠CSF，发现其部分模拟了年轻CSF对OPC增殖和长期记忆的影响。相反，通过向小鼠注入抑制性抗体阻断Fgf17会导致海马依赖性记忆测试的功能受损。综上所述，通过年轻CSF中存在的因子靶向海马髓鞘，可能是一种预防或挽救与衰老和神经退行性疾病相关认知功能下降的治疗策略。  

葛玲玲 吕卓辰

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