科研丨华科同济医学院: 肠道菌群失调通过重塑血清代谢组损害海马可塑性和行为(国人佳作)

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编译：微科盟椰子，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

越来越多的证据表明，肠道菌群作为肠-脑轴的关键介质在人类健康中发挥着重要作用。肠道微生物谱的改变与精神疾病(如自闭症、抑郁症和精神分裂症)的易感性增加有关。然而，这种关联背后的细胞和分子机制仍然未知。本研究用抗生素对新生小鼠的肠道微生物组进行修饰，发现肠道微生物的改变通过减少成体神经发生和突触传递的长时程增强，以及改变海马体中的基因表达谱来诱导行为损伤。正常肠道菌群的重建对失调小鼠的成体神经发生和行为缺陷均有治疗作用。此外，本研究表明，循环代谢物的变化介导肠道生态失调对海马可塑性和行为结果的影响。其中，血清4-甲基苯酚(肠道细菌产生的一种小芳香代谢物)的升高可导致自闭症谱系障碍(ASD)样行为障碍和海马功能障碍。综上所述，生命早期肠道生态失调及其相关代谢物的改变会导致海马功能障碍和行为障碍，本研究强调了微生物组介导的治疗精神疾病的潜在方法。  

论文ID

原名：Gut dysbiosis impairs hippocampal plasticity and behaviors by remodeling serum Metabolome

译名：肠道菌群失调通过重塑血清代谢组损害海马可塑性和行为

期刊：Gut Microbes

IF：9.434

发表时间：2022.07.24

通讯作者：鲁友明

通讯作者单位：华中科技大学同济医学院

DOI号：10.1080/19490976.2022.2104089

实验设计

结果

1.抗生素治疗会破坏肠道微生物组成

用氨苄西林(Amp)和万古霉素(Van)治疗新生小鼠四周(P1-P28)(图1)，建立了菌群失调小鼠模型。在最后一次抗生素治疗两周后，收集小鼠的粪便进行16S rDNA高通量测序。正如预期，新生小鼠接触抗生素导致肠道菌群发生巨大变化。根据Shannon和Simpson指数图2(a，b)计算，抗生素治疗的小鼠表现出较低的α多样性(物种多样性)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示(图2C)，赋形剂处理组(Con)和抗生素处理组(Amp和Van)之间的细菌结构存在明显差异。在门水平上，抗生素处理的小鼠表现出Firmicutes减少和proteobacteria增加(图2d)。在属水平上观察到赋形剂处理小鼠和抗生素处理小鼠有明显的差异。抗生素干预后，35个优势属的丰度发生了显著变化(图2E)。其中，一些细菌与神经和精神疾病有关(图S1)。 例如，据报道，在焦虑和抑郁的患者中，Alistipes、Megamonas和Parabacteroides升高；Alistipes和Butyricimonas与认知能力呈负相关；在自闭症患者和自闭症模型鼠中，Desulfovibrio、Parabacteroides和Bacteroides显著增加。

图1 实验组及时间线新生小鼠(P1)每日灌胃抗生素(氨苄西林100 mg/kg或万古霉素50 mg/kg)或对照物(蒸馏水)，连续4周(P1-P28)。第P42天收集小鼠粪便，进行16S rRNA测序。然后按OFT、EPM、MWM和三室社交测验顺序进行行为测试(P43-P56)。对于FMT治疗组，在最后一次抗生素灌胃后，对抗生素处理小鼠执行粪便微生物群转移方案(P28-P42)。之后，对动物进行上述行为测试(P43~P56)。4-甲基苯酚处理组：野生型小鼠(4周龄C57BL/6J小鼠)每天腹腔注射4-甲基苯酚(35 mg/kg)或生理盐水(对照组)，连续2周(P28~P42)。治疗结束后进行行为测试。社会行为测试结束后，将小鼠放回笼子中1.5 h诱导IEGs表达，然后立即灌流或采集脑组织。

图2 抗生素治疗导致肠道微生物组成(a)Shannon指数和(b)Simpson指数发生显著变化。数据以平均值±SEM表示，N=9-10/组，非配对双尾t检验，*P<0.001，**P<0.01，*P<0.001。(c)基于Bray-Curtis距离进行PCoA分析，以直观地探索样品的微生物组成之间的相似性和差异。N=9-10/组。括号中的百分比指每个排序轴所解释的变异比例。(d)基于加权UniFrac距离的UPGMA聚类树显示了肠道菌群在门水平上的相对丰度。N=9-10/组。(e)前35个细菌属的相对丰度热图。一些与神经和精神疾病有关的细菌用红色标出。N=9-10/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01。

2.生命早期肠道生态失调会引发焦虑并损害空间记忆

进行了一系列行为测试，以确定生命早期的肠道生态失调是否足以导致表型发育的任何变化。与对照组相比，接受抗生素治疗的小鼠在旷场测试(OFT)中的总行进距离和在中心场地花费的时间显著减少(图3a)，这表明运动活动减少，焦虑样行为增加。同样，焦虑相关的高架十字迷宫(EPM)行为测试显示，接受抗生素治疗的小鼠在开放臂中停留的时间更短，进入开放臂的次数更少(图3b)。采用Morris水迷宫(MWM)测试评估空间学习记忆，发现与赋形剂处理的对照组相比，AMP处理的小鼠从训练第3天到第6天具有更长的逃避潜伏期，并且在第6天在Van处理小鼠中发现了类似的性能(图3c)。探针试验结果表明，经抗生素处理的小鼠在目标象限的行走时间和穿越平台区域的次数显著减少，空间记忆明显受损(图3c)。在三室社交测试中，与对照组相比，接受Amp处理的小鼠在社交新颖性方面表现出损伤，而社交能力正常。Van处理的小鼠表现出社交能力下降和社交新颖性不足(图3d)。综上所述，我们的研究结果表明，生命早期肠道菌群的破坏会导致焦虑样行为，并损害社交新颖性和空间记忆。接下来我们分析了这些行为结果是否与特定细菌协同变化，通过Spearman相关性分析发现(图3e)，8个细菌属的丰度与行为指标显著相关。在抗生素治疗小鼠中，Alistipes、Helicobacter、Morganella、Desulfovibrio和Proteus的高丰度与活动能力和进入开放臂呈负相关。而Dubosiella、Parasutterella和Faecalibaculum则表现出相反的趋势，它们不仅与OFT的中心持续时间和EPM测试的开放臂进入的增加呈正相关，而且与MWM测试和三室社交测试中表现的改善呈正相关。值得注意的是，上述菌群的变化已在精神疾病患者中描述，包括焦虑、抑郁、自闭症和认知功能障碍。总之，这些特定细菌属与行为结果之间的关联进一步证明了特定细菌可能有助于调节行为。

图3 肠道生态失调增加焦虑，并损害空间记忆和社交行为。(a，b)在OFT(a)和EPM测试(b)中运动和焦虑样行为。N=9-10个/组。数据以平均值±SEM表示非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01，ns：无显著差异。(c)用MWM测试评估空间学习和记忆能力。N=9-10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01。(d)图为三室社交测试，显示了社交能力指数和社交新颖性指数。N=9-10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，**P<0.01，*P<0.001，ns：无显著差异。(e)Spearman相关分析行为结果与细菌丰度之间的关系。正斜率椭圆表示正相关，负斜率椭圆表示负相关。颜色表示Spearman相关系数ρ，ρ>0.6或ρ<-0.6的强度，P值<0.0 5为显著相关。*P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

3.肠道菌群破坏损害突触可塑性和成体神经发生

海马体是参与各种感觉、情绪和认知功能的关键大脑区域，对各种损伤非常敏感。先前的研究表明，肠道菌群的缺乏会影响海马体的结构和功能。因此，首先分析了生命早期生态失调是否影响树突棘的形态发生。与对照组相比，抗生素治疗的小鼠在背侧海马齿状回(DG)和腹侧海马CA1中表现出较少的具有成熟形态(蘑菇棘)的顶端树突棘(图4a和图S2A)，表明健康的生命早期肠道菌群促进棘突成熟。树突棘是高度动态的神经结构，其形态变化被认为是突触可塑性和长期记忆的关键。接下来确定了肠道生态失调对海马神经发生的影响。这被认为是焦虑和空间记忆的细胞模型。本研究使用5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷(EdU)和双皮质素(DCX)的抗体来标记成年海马祖细胞的增殖和神经元分化。在抗生素干预后，EDU、DCX或双标记DCX-EdU细胞阳性的细胞数量显著减少，表明与对照组相比，抗生素治疗小鼠的成体神经发生受损(图4b，图S2B)。随后，评估了肠道菌群的破坏是否对突触传递的长时程增强(LTP)产生任何影响，突触传递是突触可塑性的主要形式，是学习和记忆的细胞基质。记录场兴奋性突触后电位(fEPSPs)。在赋形剂处理组中应用短暂的高频刺激(破伤风)诱导fEPSP的LTP，而在抗生素处理小鼠中仅观察到短暂的fEPSP增加(图4c)，表明LTP受损。

图4 肠道菌群破坏会损害突触可塑性和成体神经发生。(a)高尔基染色显示背侧齿状回(dDG)的顶端树突，成熟棘突(蘑菇棘)随着肠道微生物群的破坏而减少。N=3个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，**P<0.01，*P<0.001，ns：无显著差异。(b)背侧海马区EdU和DCX阳性细胞的代表性显微照片和定量分析。N=3个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，**P<0.01，*P<0.001。(c)肠道生态失调对抗生素处理小鼠LTP的损伤，显示了HFS诱导LTP的时间进程和程度。N=9个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.001。

4.肠道菌群的破坏会改变海马区的基因表达

为了确定抗生素治疗的小鼠行为结果差异背后的分子决定因素，对海马体进行了无偏倚转录分析。研究发现，与野生型对照(图5a，b)相比，Amp处理和Van处理小鼠中149个基因和34个基因的表达水平发生了显著变化(FDR<0.1，倍数变化>2)。它们共有的11个差异基因主要编码与免疫和炎症相关的蛋白，包括Ighg2b、Lipocalin-2(Lcn2)和S100钙结合蛋白A8和A9编码基因(S100a8、S100a9)(图S3A)。LCN2和富含亮氨酸的α2-糖蛋白(LRG1)在海马神经元的表达显著增加(图5C，图S3B)。而海马神经元中LCN2的过表达被报道降低了脊髓的密度和抑制了脊髓的成熟。海马区LRG1的过度表达已被证明通过诱导突触功能障碍和降低兴奋性突触后电位而损害记忆。功能富集分析表明，大多数上调的基因属于免疫反应和过程以及凋亡过程的广泛类别(图S3C)。我们发现，肠道菌生态失调增加了cleaved-caspase-3阳性神经元的数量(图S3D)，并导致海马神经元丢失(图S3E)。转录数据显示，肠道菌群的破坏增加了病原体识别基因(Cd14、Tlr6)、免疫球蛋白基因(Igh2b、Igha)、炎症反应基因(Cd12、S100a8和S100a9)以及白细胞募集基因(Sele、Icam1和Cd24a)的表达。还发现抗生素处理的小鼠海马中CD3E-、CD11b-和CD45-阳性细胞数量显著增加。这一结果与先前的报道一致，即肠道生态失调可能会刺激免疫反应，促进免疫细胞向大脑迁移和浸润。此外，我们观察到，在野生型小鼠海马DG的社会行为测试后，包括Egr1、FosB、Npas4和CFos在内的即刻早期基因(IEGs)的蛋白表达被高度诱导，而抗生素处理导致IEGs的蛋白表达受损(图5e、图S3B和图S4)。IEGs主要编码早期反应转录因子，据报道，这些转录因子由多种刺激(如新事物和社会压力)诱导，它们与许多神经元功能有关，如突触可塑性、学习、记忆和空间探索。

图5 肠道菌群破坏改变了海马区基因表达。(a-b)肠道菌群破坏后海马区显著差异基因的热图，一些代表性基因在图中用红色标记。N=4/组，FDR校正后的P值为0.1，绝对倍数变化为2作为显著差异表达的阈值。(c)共聚焦成像显示肠道菌群破坏后，海马DG中LCN2-和LRG-1阳性细胞显著增加。N=5个/组。细胞核用DAPI染色。(d) 显示海马DG中CD3E-、CD11b-和CD45-阳性细胞。N=5个/组。细胞核用DAPI染色。(e)具有代表性的显微照片显示，抗生素治疗导致社会行为测试引起的IEGs上调的损害。N=5个/组。

5.正常肠道菌群重建挽救抗生素治疗小鼠的行为缺陷

在证明了肠道生态失调导致行为缺陷并改变了海马区的基因表达谱后，我们研究了正常肠道菌群的重建是否对肠道生态失调小鼠产生治疗效果。值得注意的是，我们发现，通过移植来自健康供体(相同年龄的SPF小鼠)的肠道菌群，抗生素处理小鼠的行为缺陷得到了显著改善(图6a，6b)。粪菌移植(FMT)处理的小鼠没有表现出焦虑样行为，如恢复在OFT测试的中心区花费的持续时间(图6a)和EPM测试中进入开放臂的次数(图6b)。FMT处理显著改善了Amp组小鼠的空间学习记忆能力和对社交新颖性的偏好，表现为在MWM测试中显著增加了目标象限的时间旅行和跨越平台次数(图6c)，在三室社交测试中显著延长了平均接触时间(图6d，图S5A)。而移植了正常菌群的Van处理小鼠在MWM测试(图6c)和三室社交测试中几乎所有参数恢复到对照水平(图6d，图S5A)。重要的是，FMT不仅挽救了行为缺陷，而且还恢复了抗生素处理小鼠的成体神经发生(图6e，图S5B和图S6)和海马LTP(图7a)。我们的结果还显示，正常菌群的重建挽救了IEGs、LRG1和LCN2的表达(图7b)。同时，抗生素处理的小鼠在FMT处理后，海马区病原体识别基因(Tlr6)、白细胞募集基因(Icam1和Lsp1)和促炎基因(Ccl12)的mRNA水平也得到恢复(图S5C)。综上所述，上述结果表明，早期生命中菌群的破坏是行为障碍、海马体转录变化和成体神经发生损伤的原因，强调了肠道菌群在调节大脑发育和行为方面的重要性。

图6 正常肠道菌群的重建对肠道生态失调小鼠产生治疗作用。(a-b) FMT恢复了肠道生态失调小鼠的运动能力，并消除了焦虑样行为。(a)OFT，(b)EPM测试。N=9-10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01，ns：无显著差异。(c-d)FMT可改善肠道生态失调小鼠的空间记忆(c)和社交活动(d)缺陷。(c)MWM测试；(d)三室社交测试。N=9-10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01，ns：无显著差异。(e)共聚焦显微图显示FMT挽救了抗生素治疗小鼠的成体神经发生。N=5个/组。

图7 FMT可恢复海马LTP和IEGs的表达。(a)FMT恢复了肠道生态失调小鼠海马区LTP的表达。显示了HFS后LTP诱导的时间进程和程度。N=6个/组。 数据以平均值±SEM表示 ，非配对双尾t检验，*P<0.001。(b)FMT可挽救IEGs、LCN2和LRG1的表达。N=6个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，**P<0.01，ns：无显著差异。

6.肠道菌群的改变引起血清代谢物的变化

越来越多的研究表明，肠道菌群不仅参与营养吸收和能量代谢，还通过产生生物活性代谢物(如短链脂肪酸和神经递质)参与调节大脑发育。本研究利用基于UHPLC-MS/MS的非靶向代谢组学方法来确定血清代谢组是否受到肠道微生物区系破坏的影响。总体而言，在血清中以正离子和负离子模式检测到946种已知代谢物。与对照组相比，Amp组小鼠血清中有139种代谢物发生显著变化(VIP>1和P值<0.05，倍数变化>2)，而Van组只有60种代谢物发生显著变化(图8a)，两组小鼠共有代谢物27种(图S7A)。从功能上讲，差异代谢物主要涉及脂类、苯类、氨基酸、碳水化合物和有机酸的代谢(图8B，图S7B)。脂质代谢物主要富含两类，其中许多对血脑屏障具有高度的通透性，可能对神经炎症和神经功能有影响，如二十烷基衍生物、甘油磷脂等。前列腺素和血栓素是二十烷类化合物的促炎代谢物，据报道参与了许多病理生理途径；12(S)-HETE是一种二十烷类化合物，在阿尔茨海默病患者中上调，被证明参与调节Aβ和tau的新陈代谢，突触完整性。除了脂质代谢物，一些分子也可能与神经功能障碍有关(图8b)。其中，过量的α-甲基多巴被报道抑制小鼠的自发运动活动，高水平的脯氨酸可降低肌酸激酶活性并诱导大鼠脑内氧化应激；孕酮是一种性腺类固醇激素，通过其全身性抗炎和BDNF调节作用发挥神经保护/调节作用。此外，研究发现一些显著变化的代谢物来自肠道菌群(图8b)，包括4-甲基苯酚、雌马酚、5-羟基吲哚-3-乙酸和马尿酸。有趣的是，代谢物4-甲基苯酚，这是一种由Coriobacteriaceae和发酵酪氨酸或甲苯的Clostridium在肠道中产生的有毒芳香化合物。4-甲基苯酚被认为是自闭症的一种可能的尿液生物标志，在母体免疫激活(MIA)处理的小鼠的后代血清中检测到高水平的4-甲基苯酚。结果表明，在生命早期肠道微生物群的变化足以引起血清代谢组的显著变化，代谢物的变化可能导致大脑发育和行为异常。

图8 生命早期的菌群失调改变了血清代谢组。(a)火山图显示了Amp组和Van组小鼠的差异代谢物。N=9-10个/组。显著性差异判定标准(VIP>1，P<0.05和倍数变化≥2)。(b)代表性差异代谢物的热图。来自肠道细菌的代谢物用“#”标记。*P<0.05，**P<0.01。

7.血清代谢物4-甲基苯酚损害海马区可塑性和社交行为

如上所述，肠道菌群破坏后，血清中几种来自肠道菌群的代谢物发生了显著变化。这些分子在与肠道菌群失调相关的行为缺陷中发挥作用吗？为了验证这一假设，本研究选择了代谢物4-甲基苯酚进行进一步验证。以前的研究报道称，暴露于4-甲基苯酚会导致间充质干细胞线粒体功能障碍，所以首先确定它对原代海马神经元是否有同样的影响。实时荧光定量显示(图9a)，4-甲基苯酚暴露可上调细胞内丝裂融合相关基因(Mfn1和Opa1)和促凋亡基因caspase-3的表达，降低细胞周期相关基因(Cdk2、Cdk4和cyclinD1)和抗凋亡基因Bcl2的表达。此外，4-甲基苯酚可显著降低cFos、Egr1、Npas4和NMDAR1的表达，增强Lcn2和S100A9的表达。此外，免疫印迹分析显示，经4-甲基苯酚处理后，S100a8、S100a9、cleaved-caspase-3等几种促炎症和促凋亡蛋白也有过表达(图9b)。

接下来，研究了增加血清4-甲基苯酚是否足以导致幼鼠的任何行为异常。小鼠(4周龄)每天服用4-甲基苯酚或赋形剂，连续两周。与对照组相比，4-甲基苯酚处理的小鼠在OFT中增加了运动活动(图9c)，EPM测试中进入开放臂的次数和花费的时间减少，表现出一些焦虑样行为(图9d)。同样，4-甲基苯酚处理的小鼠表现出社交障碍，社交指数和社交新颖性指数降低(图9e，9f)。此外，4-甲基苯酚处理显著降低了社会行为测试诱导的IEGs表达上调(图9G，图S8A)，并增加了LCN2、LRG1、S100a8、S100a9和cleaved-caspase-3的表达(图9h，9i)。随着炎症和凋亡信号的增强，海马CA1和DG神经元丢失(图S8B-S8C)。海马区LCN2和LRG1过表达已被证明可抑制棘突成熟并导致突触功能障碍。上述数据表明，细菌代谢物4-甲基苯酚通过降低海马可塑性和促进神经元的炎症和凋亡而导致行为损伤。综上所述，结果表明，血清中4-甲基苯酚水平升高通过增加焦虑和减少社交活动而特异性地引起ASD样行为障碍，表明生命早期中的代谢变化有助于精神障碍的发生和发展。鉴于许多血清代谢物在肠道菌群失调后发生了显著变化，更复杂的行为变化可能会被这些代谢物的组合所调节。

图9 细菌代谢物4-甲基苯酚损害社交行为和海马可塑性。(a)实时RT-PCR和(b)蛋白质印迹分析显示暴露于4-甲基苯酚的原代海马神经元的差异基因。用60 μM的4-甲基苯酚处理细胞48 h，同时加入二甲基亚砜作为对照。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，*P<0.05，ns：无显著差异。(c-d)在OFT(c)和EPM测试(d)中，4-甲基苯酚对运动活动和焦虑样行为的影响。N=10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，**P<0.01，ns：无显著差异。(e-f)给新生小鼠注射4-甲基苯酚会损害其社交性(e)和社交新颖性(f)。每天给野生型小鼠腹腔注射(4周龄)生理盐水或4-甲基苯酚(35 mg/kg)，连续两周。N=10个/组。数据以平均值±SEM表示，非配对双尾t检验，**P<0.01，*P<0.001。(g)具有代表性的显微照片显示，4-甲基苯酚处理减少了社交测试诱导的IEGs表达上调。N=4个/组。(h)具有代表性的显微照片显示，4-甲基苯酚处理增加了海马DG内LCN2和LRG1阳性神经元的数量。N=4个/组。(i)共聚焦显微镜显示S100a8、S100a9和cleaved-caspase-3在4-甲基苯酚处理的小鼠海马区过表达。N=4个/组。

8.宿主血清代谢物与肠道菌群的关系

为了研究肠道微生物群改变和受干扰的血清代谢物之间的潜在相关性，评估了不同代谢物和肠道细菌丰度之间的Spearman相关系数，并以热图的形式显示(图10)。结果表明，多种神经活性代谢物水平与优势微生物属的相对丰度呈显著正相关(ρ>0.6，P<0.05)。代谢物4-甲基苯酚与Clostridioides呈显著正相关，这一结果与以往报道的产4-甲基苯酚的细菌主要属于Clostridium一致。促炎代谢物蛋白类(前列腺素B2、血栓素B1和B2)和二十烷类衍生物((±)8(9)-EET和12(S)-HETE)与Lachnoclostridium、unidentified_Prevotellaceae和Butyricimonas呈显著正相关，与溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、二十碳五烯酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸也呈显著正相关。相反，具有神经保护作用的代谢物(R)-equol与条件致病菌Alistipes和在抗生素处理小鼠中富集的Desulfovibrio呈显著负相关。此外，还发现一些细菌，包括Lachnoclostridium、unidentified_Prevotellaceae和Butyricimonas，可能在维持宿主的代谢稳态中发挥关键作用，因为它们与许多血清代谢物的变化相关。综上所述，这些研究结果表明，特定的肠道细菌可能对宿主代谢的调节有很大贡献，这与以前的报告一致，即肠道微生物群参与调节多种宿主代谢途径，在人类健康和疾病中发挥重要作用。

图10 血清差异代谢物和优势细菌属之间Spearman相关性的热图分析。负倾斜的椭圆表示负相关，而正倾斜的椭圆表示正相关。颜色表示Spearman相关系数ρ，ρ>0.6或ρ<-0.6的强度，P值<0.0 5为显著相关。*P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

讨论

越来越多的证据表明肠道微生物群在神经精神疾病的病理生理学中的重要性。然而，它们之间的因果关系仍未建立起来。在本研究中，生命早期肠道菌群失调通过重塑血清代谢物来损害神经发育，并观察到血清4-甲基苯酚增加导致ASD样行为缺陷。出生后的生命早期是微生物群在小鼠和人类体内定植的关键时期。此外，分娩方式、母乳喂养、饮食等多种因素也显著影响肠道菌群的动态平衡。例如，与阴道分娩的婴儿相比，剖腹产的婴儿肠道细菌多样性减少，并增加了患自闭症和注意力缺陷的风险。食用西方饮食会损害认知功能，并通过改变肠道微生物增加焦虑。鉴于肠道菌群在早期生命中的脆弱性以及肠道与大脑的双向互动，许多成人神经精神疾病的根源是这个关键的发育窗口也就不足为奇了。抗生素的广泛应用构成了早期生命生态失调的重要原因。研究结果表明，某些细菌可能对人类健康和疾病特别重要。抗生素处理小鼠中Alistipes、Megamonas、Desulfovibrio、和Butyrimimonas丰度增加，而其他细菌则显示出相反的趋势，如Dubosiella、Parasutterella和Faecalibaculum。这种细菌的具体变化已在重度抑郁症、自闭症、记忆缺陷和胃肠道疾病的患者中被报道。值得注意的是，这些细菌或积极或消极地与失调小鼠的行为结果协同变化。而正常菌群的重建挽救了行为缺陷，表明肠道菌群在调节中枢神经系统发育中起着因果作用。并非所有的菌群成员对宿主都有同样的影响，一些细菌可能通过特殊的机制影响宿主，如促进炎症和产生生物活性代谢物。因此，了解特定细菌种群对大脑发育的影响将为临床干预和治疗与肠道生物失调相关的精神疾病铺平道路。本研究证明，生命早期中的肠道菌群失调损害了通过重建正常菌群恢复的海马神经发生。成体神经发生是调节大脑功能和行为的重要过程。成体神经发生的减少与几种精神疾病有关，如焦虑、抑郁和记忆力丧失。据Cavallucci等人研究发现，神经发生是由几个内在和外部因素协调的，如炎症细胞因子、神经递质、体力活动和饮食摄取。此外，据Möhle研究显示，在ABX治疗的小鼠中，Ly6Chi单核细胞参与调节海马神经发生。吲哚，膳食色氨酸的微生物代谢物，被发现通过芳香烃受体途径增加成体神经发生。慢性应激处理小鼠的肠道菌群通过损害Trp代谢而减少健康小鼠的神经发生。肠道菌群失调对神经发生的影响可能是由多个方面驱动的，如免疫细胞的渗透和循环代谢物的变化。

之前的研究表明，肠道菌群和益生元可调节与海马区乳酸穿梭相关的基因的mRNA表达。本研究转录分析表明早期肠道菌群失调导致海马区的分子变化。肠道菌群破坏后，Lcn2和Lrg1两个基因在海马神经元中都有过表达，进一步证明肠道菌群产生的代谢物4-甲基苯酚的水平升高可能介导了这些基因的上调。以前的证据表明，在脑内注射细菌脂多糖(LPS)可以强烈诱导LCN2的表达。有研究表明，海马神经元中高水平的LCN2导致棘突密度和蘑菇棘比例下降。LRG1是一种大脑丰富的LRR蛋白，已被发现抑制BDNF诱导的海马神经元树突形态。LRG1在脑中过表达导致记忆障碍。综上所述，不仅表明LCN2和LRG1的过表达导致了生态失调后的行为缺陷和树突形态的变化，而且表明肠道菌群参与了对其表达的调节。

IEGs被称为大脑中神经活动的分子标志物，在各种外部刺激和行为经验的作用下迅速产生。它们被认为对突触可塑性、海马区记忆和长期情绪变化至关重要。有报道称，注射反义寡核苷酸导致海马区IEGs表达减少会损害学习和记忆。本研究进一步发现抗生素处理诱导的菌群失调抑制了社交测试后海马区IEGs表达的增加(图5E，图S4)。进一步研究发现，细菌代谢物可能介导了这种变化，如4-甲基苯酚(图9g，图S8A)。最近的一项研究也描述了肠道微生物群对社会行为测试后IEGs表达的影响。其结果表明，与野生型对照相比，GF小鼠和ABX或AVNM小鼠的海马DG区cFos的表达增加。这种IEGs表达的差异可能来自不同的小鼠模型：GF小鼠从出生起就没有活的微生物。而ABX或AVNM(1 g/L氨苄西林、0.5 g/L万古霉素、1 g/L新霉素和0.5 g/L甲硝唑的组合)治疗经常被报道为完全清除肠道微生物。在本研究中，新生小鼠被单一的抗生素(氨苄西林或万古霉素)处理以诱导肠道菌群失调(图2)，而不是完全失去肠道菌群。另一个原因可能在于IEGs的表达受到多种机制的调控，如组蛋白乙酰化和去乙酰化、转录延伸因子、血清反应因子和cAMP反应元件结合蛋白。IEGs的异常表达可能显著影响关键神经回路中的神经元功能。事实上，在神经退行性变、脑损伤、病理刺激和神经元凋亡过程中，已经发现IEGs的下调。

与肠道微生物群在调节营养吸收和代谢动态平衡方面的作用相一致，本研究证明了菌群对宿主血浆生化的巨大影响，并发现血清代谢物的变化导致了海马体和行为的损害。越来越多的证据表明，肠道菌群在食物和外源生物的代谢过程中会产生各种生物活性小分子，其中许多对人类健康和疾病都有直接作用，即使是单一的代谢物也可能对宿主有益或有害。据报道，微生物衍生丁酸盐可以增强肠道屏障功能和粘膜免疫力；而血液中较高的氧化三甲胺(TMAO)可通过增加海马神经炎症来导致认知功能障碍。本研究发现增加血液中4-甲基苯酚的水平，足以通过减少社交活动和增加幼龄小鼠的焦虑来诱导ASD样行为障碍。最近的一项研究表明，4-甲基苯酚处理引起了小鼠菌群组成和ASD核心行为症状的变化。综上所述，这些发现可能为通过干预肠道菌群和4-甲基苯酚的产生来治疗ASD铺平道路。

本研究结果表明，两种不同抗生素诱导的生命早期肠道生态失调导致了相似的小鼠海马区功能障碍和行为损伤，并表明血清代谢物的变化可能参与了这种影响。然而，在其潜在的机制上可能存在差异。两组抗生素干预小鼠在肠道菌群和海马区转录变化的组成和结构上存在差异。更重要的是，Amp组和Van组小鼠的血清代谢组学有显著差异，尽管它们有一些共同的差异代谢物。Van组小鼠血清中4-甲基苯酚水平显著升高。结果进一步表明，血清4-甲基苯酚的增加损害了海马可塑性，并诱导了ASD样行为缺陷。然而，Amp处理的小鼠血清中4-甲基苯酚有一定程度的下降，这表明其他代谢物或代谢物组合可能与行为障碍有关。在Amp处理的小鼠中，脂质和类脂物质占血清差异代谢物的很大部分(图S7B)，特别是属于甘油磷脂和二十烷类化合物的分子(图8B)。甘油磷脂在大脑中高度丰富，被发现是神经膜的关键成分，参与树突的分支和生长。Farooqui研究表明，大脑用于合成甘油磷脂的多不饱和脂肪酸是从胃肠道转运到那里的。因此，血清甘油磷脂可能有助于建立正确的树突形态。在急性脑损伤、阿尔茨海默病和精神分裂症中，甘油磷脂成分发生了变化。二十烷类是是20-碳多不饱和脂肪酸的氧合衍生物，在许多生理活动中发挥重要作用，主要参与调节炎症和免疫。此外，其他代谢物也可能是Amp处理小鼠神经功能异常的原因(图8b)。例如，谷氨酸和天冬氨酸作为神经递质被报道在大脑功能中发挥重要作用，而其过量摄入可对神经系统造成损害；据报道，代谢物苯乙烯对大脑中的多巴胺和5-羟色胺有明显影响；赖氨酸代谢物L-pipecolinic酸被证明参与突触传递和诱导神经元细胞凋亡。综上所述，抗生素处理小鼠的表型损伤和海马功能障碍可能是由多种血清代谢物的变化引起的。

本研究结果表明，生命早期肠道生态失调通过重塑血清代谢组来损害海马可塑性和行为。许多研究表明，海马区特别容易受到微生物组成变化的影响。事实上，在GF小鼠的前额叶皮质和杏仁核中也观察到了分子变化。接受抗生素治疗的小鼠前额叶皮质、杏仁核和其他脑组织是否有变化？前额叶皮质(PFC)在调节认知、焦虑和社交行为方面起着重要作用。先前的研究表明，GF小鼠改变了成年PFC的髓鞘形成、microRNA表达和脂质代谢。本研究对抗生素处理小鼠的髓鞘基因和BDNF的表达是否发生了变化进行了一些探索；然而，与野生型对照相比，这些基因没有发现明显的差异(图S9)。遗憾的是，我们缺乏对生命早期肠道生态失调是否会导致PFC结构和功能变化的深入研究。杏仁核是参与情绪处理和调节的大脑核心区域，也是肠道菌群失衡的另一个潜在靶点。新的证据表明，小鼠的GF状态改变了树突状细胞的形态，改变了杏仁核即刻早期基因和神经活动相关基因的表达。我们对PFC和杏仁核的潜在变化非常感兴趣，未来可能会对抗生素治疗的小鼠进行更系统的研究。

综上所述，本研究发现出生后的生命早期是肠道生态失调通过重塑血清代谢组而损害神经发育的关键时期。本研究强调了微生物代谢物在生命早期大脑发育和行为中的重要作用，并强调了微生物组介导的治疗神经发育障碍的潜在方法。然而，还需要进一步的研究来揭示肠道-大脑通讯的确切机制，并调查特定细菌在大脑发育中的作用。

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https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2022.2104089