舌菖蒲对草酸盐诱导的氧化应激和上皮间质转化 (EMT) 的细胞保护潜力

Insights into the cytoprotective potential of Bergenia ligulata against oxalate-induced oxidative stress and epithelial–mesenchymal transition (EMT) via TGFβ1/p38MAPK pathway in human renal epithelial cellsCite this article

Singh, A., Tandon, S., Kumar, D. et al. Insights into the cytoprotective potential of Bergenia ligulata against oxalate-induced oxidative stress and epithelial–mesenchymal transition (EMT) via TGFβ1/p38MAPK pathway in human renal epithelial cells. Urolithiasis 50, 259–278 (2022). https://doi.org/10.1007/s00240-022-01315-4

通过人肾上皮细胞中的 TGFβ1/p38MAPK 通路，深入了解舌菖蒲对草酸盐诱导的氧化应激和上皮间质转化 (EMT) 的细胞保护潜力

草酸盐暴露于人肾上皮细胞会引发氧化应激的恶性循环，导致细胞损伤和草酸钙晶体沉积在受损细胞上。这导致进一步的氧化损伤，引起炎症和细胞 - 细胞粘附因子的丧失，最终导致无法弥补的肾脏损伤。然而，这些事件可以通过在传统医学系统中用于治疗肾结石的富含抗氧化剂的植物来减弱或预防。为了描述白芍提取物在草酸盐诱导的损伤中发挥细胞保护作用的机制，我们设计了这项研究。我们的研究结果表明，草酸盐损伤的 HK2 细胞与Bergenia ligulata乙醇提取物共同处理由于细胞内活性氧（ROS）的产生减少和细胞凋亡减少，显示出增加的活力，减少了氧化应激。我们还观察到炎症标志物降低，上皮标志物 E-钙粘蛋白表达增加，间充质标志物波形蛋白、F-肌动蛋白、转化生长因子 β1 (TGF-β1) 和 EMT 相关蛋白在肾小管上皮细胞中的表达降低通过免疫细胞化学、实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹。我们的研究结果共同表明，通过减少氧化应激、调节晶体结构和防止晶体-细胞粘附，B. ligulata通过下调各种介质来抑制 EMT 途径，从而发挥其细胞保护作用。

图形概要

        需要识别与结石形成相关的风险因素并找到可以预防或帮助其管理的策略是一项挑战。由于肾结石被认为是导致肾小球肾炎、肾小管间质纤维化、慢性肾病 (CKD) 和终末期肾病 (ESRD) 最终导致肾衰竭的感染和损伤的主要危险因素，因此这个问题的严重性变得更加重要[ 1    , 2   ]。在过去的几十年中，肾结石的发病率有所增加，这可归因于与肥胖、高血压、2 型糖尿病等疾病以及饮食和环境条件等外在因素相关的生活方式引起的代谢紊乱。目前的研究结果表明，代谢综合征各个成分的聚集与肾结石的发生和严重程度有关 [ 3    ]。  

最常见的结石由钙和草酸盐 (CaOx) 组成。暴露于草酸盐会调节细胞环境中和周围存在的各种蛋白质，这会影响在肾小管上皮细胞中运作的许多途径 [   4   ]。这些途径之间的串扰非常复杂，在结石形成的情况下，仍未完全阐明。CaOx 结石的形成通过各种机制起作用，这些机制涉及氧化应激、炎症、上皮间质转化 (EMT)，并最终导致细胞死亡 [   5  ]。通常，身体会通过一些抑制这一过程的大分子来保护自己免受病理结晶的影响。肾脏中存在的内在蛋白质包裹着晶体并阻止它们与分化的肾小管上皮细胞相互作用，这些细胞本身对这些微小晶体几乎没有或没有亲和力 [   6   ,   7   ,   8   ]。然而，如果肾膜受损，则细胞-晶体粘附和滞留的倾向会增加。

研究表明，草酸盐水平升高导致 ROS 产生增加，并且 ROS 诱导的过氧化损伤被认为是导致 CaOx 晶体与肾上皮细胞结合的主要触发因素。然后，细胞-CaOx 晶体相互作用开始引发一系列事件，导致结石形成 [   9   ]。草酸盐诱导的过氧化损伤导致 TGF-β1 [   10   ,   11   ] 的诱导，可进一步激活 NADPH 氧化酶，导致肾小管上皮细胞产生 ROS [   12   ,   13   ]。升高的 ROS 水平可进一步导致 EMT，这也已被证明在肾上皮细胞的 CaOx 结晶病理学中起关键作用。  14   ]。EMT现象导致极化上皮表型的丧失，这可以通过E-钙粘蛋白的减少或丢失以及波形蛋白和N-钙粘蛋白的上调来证实。E-cadherin 的这种下调是 EMT 的经典标志，导致细胞间相互作用减弱以及细胞骨架变化 [   15   ]。由于间充质表型，肌动蛋白结构从上皮细胞的皮质区域重组到应力纤维的形成，在细胞存活和细胞死亡中起重要作用 [   16   ]。由于草酸盐损伤而观察到的肌动蛋白细胞骨架聚合可能在调节基因表达和诱导 EMT 中发挥关键作用 [   17  ]。由于 EMT，上皮细胞失去极性并获得成纤维细胞或间充质表型、迁移能力和侵袭性 [   18   ]。有趣的是，研究表明，如果在早期时间点去除应激源/信号，由于草酸盐/CaOx 暴露于肾小管细胞，EMT 诱导的转分化是可逆的 [   19   ]。这可能导致一种重要的管理方案，用于预防和可能逆转导致 CaOx 矿化的事件的后遗症。

清除自由基可以对 CaOx 晶体的形成产生抑制作用，在这方面，抗氧化剂通过螯合氧化还原活性离子充当自由基链破坏剂。类黄酮化合物，例如绿茶儿茶素 (EGCG)，通过其抗氧化特性调节结石形成过程。儿茶素减少细胞内 ROS 生成的能力已证明可抑制与 CaOx 结晶相关的各种过程 [   20   ]。在水果和蔬菜中发现的山奈酚具有抗氧化和抗炎特性，并被证明可以减轻氧化应激和炎症，从而减少 CaOx 晶体的沉积 [   21   ]。B.舌形（虎耳草科）是亚洲的一种本土植物，由于其多种药用特性，几个世纪以来一直用于传统医学系统 [   22   ]。这种植物的提取物已被用于治疗多种病理状况，因为它们具有抗炎、伤口愈合、利尿、免疫调节和镇痛特性 [   23   ,   24   ]。

以前的研究试图阐明 B. ligulata [   24   ,   25   ] 通过防止矿化或溶解肾结石对结石形成的抑制作用。然而，在这一复杂过程中受到调控的分子途径仍需进一步探索。我们之前已经在大鼠肾上皮细胞中证明，B. ligulata的乙醇提取物可以抑制成核和聚集过程并下调炎症信号 [   26   ]。在结石形成的多步骤过程中，EMT 正在成为主要参与者；然而，B. ligulata的作用尚未探索与结石形成有关的 EMT 通路的调节。因此，本研究旨在调查B. ligulata是否能够证明下调 EMT 的关键驱动因素的能力，并提供对其可以减轻人肾上皮细胞中草酸钙矿化过程的潜在机制的见解。

材料和方法

化学品

使用的所有化学品均为分析级。Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich)、青霉素 G (100 units/mL)-链霉素 (10,000 μg/mL) (Gibco)、胎牛血清 (FBS) (Gibco)、0.25% 胰蛋白酶 (Gibco)、 0.4% 台盼蓝溶液 (Himedia)、磷酸盐缓冲液 (PBS) (Himedia)、吖啶橙 (AO; MP Biomedicals)、溴化乙锭 (EtBr; MP Biomedicals)、碘化丙啶 (PI) (Himedia)、PerXOquantTM 定量过氧化物测定试剂盒 (Thermo Scientific)、多聚甲醛 (PFA; Sigma-Aldrich)、戊二醛 (Sigma-Aldrich)、Cystone (Himalaya Herbal Healthcare)、甲醇（SRL 化学品）、Folin–Ciocalteu's (Himedia) 乙醇（SRL 化学品）、草酸钠（ Himedia)、Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)、Active Caspase-3 Apoptosis Kit (BD Biosciences) 和 FITC-conjugated Phalloidin (Thermo Scientific)，DCFH-DA（Thermo Scientific）、过氧化氢试剂盒（Thermo Scientific）、DPPH（Himedia）、Triton-X（Sigma-Aldrich）、牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich）、4',6-diamidino-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma-Aldrich，印度）、DNase（Qiagen）、Mper 缓冲液（Thermo Scientific）、磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific）、BCA 试剂（Thermo Scientific）、Femto 试剂（Thermo Scientific）、PVDF 膜（Merck）。一抗如骨桥蛋白、p38α丝裂原活化蛋白激酶和 NF-ĸB 购自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)、波形蛋白和 E-cadherin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 和 TGF-β1购自 ABCAM。Alexa 面粉 555 和 Alexa 面粉 488 由 Thermo Scientific 提供。二抗，HRP 偶联山羊抗兔 IgG 和 HRP 偶联，

植物材料和提取物制备

白芍作为干燥的根茎从当地供应商（印度新德里 Chandni Chowk）购买，经印度新德里国家科学传播和信息资源研究所 (NISCAIR) 鉴定和认证，证书编号：NISCAIR/RHMD/Consult/2017 /3085-34。供应商通过电动研磨机将植物粉化，并将粉化的植物根茎在环境温度下储存在密封容器中。为了制备储备溶液，将 10 g 干燥的粉末状植物根茎浸泡在 40 mL 乙醇中，并在 37 °C 的培养箱中保持 24 h。将滤液通过Whatman 1级滤纸收集在烧瓶中，并使用旋转蒸发仪在减压下蒸发至干，并储存在4°C直至进一步使用。阿育吠陀药物 Cystone 是 Himalaya Herbal Healthcare 的商业产品，

总酚和类黄酮含量的测定

Zafar 等人描述的改进程序用于测定白芨根茎提取物中的总酚含量。紧随其后 [   27   ]。将 1 mL 的B. ligulata提取物 (200 µg/mL) 与 2.5 mL 的 10% Folin–Ciocalteu 试剂混合。5 分钟后，将 2 mL 碳酸钠 (7.5%) 添加到混合物中，并在 50 °C 下再孵育 10 分钟。提取物中酚类物质的含量与分光光度法在 765 nm 处测量的吸收强度成正比，并表示为 mg/g 没食子酸当量。黄酮含量采用氯化铝法测定。将 0.3 mL B. ligulata提取物的测试样品与 3.4 mL 30% 甲醇、0.15 mL NaNO 2混合(0.5 M) 和 0.15 mL AlCl 3 .6H 2 O (0.3 M) 在烧瓶中。10 分钟后，加入 1 mL NaOH (1 M)。将溶液充分混合，并使用分光光度计 [   28   ] 在 506 nm 处针对试剂空白测量吸光度。

自由基清除活动

通过 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 测定法评估了B. ligulata乙醇提取物清除自由基的能力。在甲醇中制备 0.135 mM DPPH 溶液，并将 1 mL 该溶液与 1 mL 甲醇提取物混合。将反应混合物彻底涡旋并在室温下避光孵育 30 分钟。用分光光度法在 517 nm 处测量混合物的吸光度，并按公式计算清除活性。DPPH 自由基清除活性 (%) = {[(Abs 对照- Abs 样品)]/(Abs 对照)} × 100。

细胞培养

为了确定舌螈乙醇提取物对肾上皮细胞的抗结石作用，对购自美国 ATCC 的人肾上皮细胞系 ( HK2 ) 进行了实验。在补充有 1% 青霉素 G (100 单位/mL) 的 Dulbecco's Modified Eagle 培养基 (DMEM) 中，在 37 °C 和 5% CO 2的培养箱（Eppendorf, New Brunswick- Galaxy 170S）中培养和维持肾细胞为单层细胞–链霉素 (10,000 μg/mL) 和 10% 胎牛血清 (FBS)。

细胞系研究的样品制备

B. ligulata乙醇提取物(20 mg/mL) 的储备溶液在 DMSO 中制备，并在 DMEM 无血清培养基中进行连续稀释 (10–1000 μg/mL)，并通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤。用于各种测定的提取物中 DMSO 的浓度不超过 0.4% v/v。Cystone作为阳性对照。

草酸盐晶体制备

对于基于细胞系的研究，制备草酸钠 (10 mM) 储备溶液，通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤，并在层流气流中在紫外线下灭菌 3 小时。将溶液在无血清 DMEM 培养基中稀释至 2 mM，并将 HK2 细胞与不同浓度的B. ligulata或 Cystone的乙醇提取物一起暴露于 2 mM 草酸钠 24 小时。

检测细胞活力

如前所述 [   26   ] 通过台盼蓝细胞活力测定法分析存在 CaOx 晶体和乙醇提取物时 HK2 细胞的活力。染色细胞与细胞总数的比率用于确定总活细胞的百分比。碘化丙啶 (PI) 染色染料用于使用 Accuri C6 流式细胞仪 (BD Sciences) 通过流式细胞术研究细胞毒性。如前所述接种和处理HK2细胞。处理 24 小时后，将上清液和胰蛋白酶消化的细胞悬液沉淀，用 1X PBS 洗涤三次，加入 5 μL PI (5 μg/mL) 染色溶液。然后将细胞在室温下在黑暗中孵育 10-15 分钟。然后用PBS洗涤细胞两次并分析。

细胞死亡评估

将 HK2 细胞接种（2 × 10 5 个细胞/孔）在放置在 6 孔板中的盖玻片上，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育，直到它们半汇合，并用 2 mM 草酸钠处理 24 小时单独使用或与 200 µg/mL舌形木耳的乙醇提取物共同处理，这已显示出最大的抗锂化潜力。进行双重染色技术，即吖啶橙 (AO) 和溴化乙锭 (EB)，以检测细胞死亡（细胞凋亡和坏死）的特征性变化。处理期结束后，弃去培养基，用1×PBS冲洗细胞。每个测试样品，含有 10 μL 等体积的 AO (50 μg/mL) 和 EB (50 μg/mL) 荧光染料，在室温下避光 5 分钟，并在 15-20 分钟内使用荧光显微镜 (Nikon eclipse, Ti) 放大 20 倍。

使用细胞凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen）检测细胞凋亡和坏死。在 60 mm 培养皿中培养密度为 2 × 10 5 个细胞的 HK2 细胞。在半融合水平，对照组更换为无血清DMEM培养基，草酸盐损伤组更换为2 mM草酸盐晶体培养基，试验组更换为2 mM草酸盐+200 μg/mL的B. ligulata提取物并孵育24 小时。将用 10 μM CCCP-羰基氰化物 3-氯苯腙 (Sigma-Aldrich) 处理的细胞作为阳性对照，因为它通过破坏线粒体膜电位来诱导细胞凋亡。随后，细胞被胰蛋白酶消化，沉淀下来，在冷的 1X PBS 中洗涤两次，并以 10 6的浓度重新悬浮在 1X 结合缓冲液中细胞/毫升。然后将沉淀用 5 μL 标记为膜联蛋白 V 的异硫氰酸荧光素 (FITC) 和 5 μL PI 染色，并在室温下避光孵育 15 分钟。在此之后，将 400 μL 1X 结合缓冲液添加到每个管中，然后通过流式细胞仪 (Accuri C6, BD Biosciences) 进行分析。

Caspase 3 是细胞凋亡的标志物，通过 Caspase 3 检测试剂盒（BD Biosciences）检测。Ac-DEVD-AMC 是一种合成荧光探针，用于量化凋亡细胞中的 caspase-3 活性。当激活的 caspase-3 切割 Ac-DEVD-AMC 时，会释放荧光 AMC，并对其进行量化。细胞以 2 × 10 5的密度接种细胞在 60 mm 培养皿中，并如前所述进行处理。处理期后，用 PBS 洗涤细胞，重悬于冷的细胞裂解缓冲液中并在冰上孵育 30 分钟。对于每个反应，将 5 μL 重构的 Ac-DEVD-AMC 添加到含有 50 μL 细胞裂解物的 200 μL HEPES 缓冲液中，并在 37 °C 下孵育 1 小时。根据制造商的说明，使用荧光计在 380 nm 的激发波长和 420–460 nm 的发射波长范围内测量从 Ac-DEVD-AMC 释放的 AMC 的量。

测量 ROS 水平

根据制造商的说明，使用 PerXOquantTM 定量过氧化物测定试剂盒 (Thermo Scientific) 测量B. ligulata提取物的细胞过氧化氢清除能力。将细胞以 1 × 10 4细胞/孔的密度接种在 96 孔微孔板中。将细胞用草酸盐处理或用B. ligulata的乙醇提取物共同处理 24 小时。处理期结束后，将 50 μL 上清液加入到新鲜孔中的 200 μL 工作试剂中，并在室温下孵育 15 分钟（试剂盒按说明提供）。使用酶标仪在 595 nm 处测量吸光度。细胞 H 2 O 2浓度通过以下公式计算： % 细胞 H 2O 2水平 = [（样品吸光度）/（对照吸光度）] × 100。

使用非荧光探针 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 检测细胞内氧化剂种类的水平。DCFH-DA 扩散到细胞中并脱乙酰基形成非荧光的 2,7-二氯二氢荧光素 (DCFH)。在 ROS 存在下，DCFH 与 ROS 反应形成荧光 2,7-二氯荧光素 (DCF)。使用 DCFH-DA 监测草酸盐诱导的 ROS 的细胞内产生及其与B. ligulata乙醇提取物的共同处理。简而言之，收集来自不同处理组的细胞并与 10 μmol/L DCFH-DA 在 37 ℃下孵育 20 分钟，然后用 PBS 洗涤两次以去除细胞外 DCFH-DA。然后通过 FACS (Aria III, BD Biosciences) 分析样品。

晶体 - 细胞相互作用和粘附

将细胞以 2 × 10 5 个细胞的密度接种在无菌玻璃盖玻片上，并置于含有 DMEM 的 6 孔板中，温度为 37°C 和 5%，直到它们达到约 70% 汇合。HK2 细胞仅用 2 mM 草酸钠损伤或用 200 µg/mL B. ligulata乙醇提取物共同处理24 小时。处理后去除 DMEM 培养基，用 1X PBS 洗涤细胞两次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。孵育后，细胞在室温下在黑暗中用 5 μg/mL 的 Hoechst 33,258 染料（Sigma-Aldrich）染色 10 分钟。再次用 1 × PBS 洗涤细胞以去除过量的染料并在相差显微镜下观察，并在 DAPI 荧光滤光片下使用 Nikon Eclipse Ti eclipse 倒置显微镜在 20 × 物镜下观察染色的细胞核。分析荧光强度的统计分析，并将获得的数据绘制为校正的总细胞荧光 (CTCF) 强度曲线。Image J 软件使用以下等式：CTCF = 综合密度 - （选定细胞的面积 × 背景读数的平均荧光）。

进行扫描电子显微镜以观察由于草酸盐损伤引起的细胞-晶体相互作用、粘附和形态调节的影响。用 4% 多聚甲醛和 1% 戊二醛在室温下将草酸盐和B. ligulata提取物处理的 HK2 细胞固定 30 分钟。盖玻片用 1X PBS 洗涤两次，脱水并风干过夜。然后将干燥的盖玻片安装在铝柱上并涂上铬。然后在扫描电子显微镜（ZEISS EVO HD，德国）下检查晶体的内化及其形态。

H&E染色法用于降低细胞质透光率，从而通过光学显微镜观察细胞-晶体粘附。简而言之，将HK2细胞以10 5 个细胞/盖玻片的接种密度接种在放置在6孔板中的无菌盖玻片上。将板保持过夜，然后如前所述进行处理。对于对照组，细胞培养基用含有CaOx (2 mM)的无血清DMEM代替，试验组用B. ligulata共同处理提取物 (200 μg/mL) 24 小时。Cystone (200 μg/mL) 作为阳性对照。将样品在室温下用 4% PFA 固定 20 分钟，用 PBS 洗涤并用 Mayer's 苏木精溶液染色 5 分钟。然后用蒸馏水和 1X PBS 冲洗样品。将载玻片依次浸入 70% 和 90% 乙醇中各 1 分钟，然后用酒精伊红溶液复染 5 分钟。载玻片用 100% 乙醇脱水 1 分钟，然后在 Nikon Eclipse Ti eclipse 显微镜下在 20 × 物镜下观察。

评估细胞骨架变化

为了探索细胞骨架的变化，HK2 肾上皮细胞用异硫氰酸荧光素 (FITC)-鬼笔环肽染色。将细胞以 1 × 10 5 个细胞/孔的密度接种在 6 孔板的盖玻片上。在半汇合水平，对照组用无血清DMEM培养基代替培养基，用2 mM草酸盐+ 200 μg/mL的B. ligulata损伤细胞试验组提取液，损伤组用浓度为 2 mM 的草酸盐晶体损伤细胞，37 ℃孵育 24 h。处理期后，弃去培养基，用冷 PBS 洗涤细胞三次，并在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，然后在室温下用 0.4% Triton-X 100 膜透化 10 分钟。将载玻片与 100 μL FITC 缀合的鬼笔环肽一起孵育 60 分钟，用核染料 DAPI (5 μg/mL) 洗涤和复染，并在 60 倍 (Nikon Eclipse Ti-E) 下显示多个视野。然后通过 Image J 软件绘制使用校正的总细胞荧光的强度分布图。

免疫荧光 (IF)

将HK2细胞接种到6孔板中并如上所述处理。用 PBS 洗涤细胞并在 4% 多聚甲醛中固定 30 分钟，然后用 0.4% Triton-100 进行膜透化 20 分钟。然后用 1 × PBS 冲洗细胞，并在 37 °C 下用 PBST 中的 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭 1 小时。与骨桥蛋白、p38α-MAPK、NF-ĸB、TGF-β1、E-钙粘蛋白和波形蛋白的稀释度为 1:100、1:500 和 1:1000 的一抗在 4°C 孵育过夜后，将细胞与 Alexa 孵育fluor 488 和 555 二抗在 37 °C 下避光 1 小时，用 DAPI (5 μg/mL) 复染并定量荧光表达。

基因表达分析

将肾上皮细胞以 1 × 10 6细胞的密度接种在 60 mm 培养皿中，并如先前实验中所述进行处理。使用 TRizol 从细胞中提取总 RNA，并使用 Thermo NanoDrop 测量 RNA 浓度。根据 verso cDNA 合成试剂盒说明书，将总 RNA 逆转录为 cDNA。使用 Powerup SYBR Green Master Mix 的 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 已完成。使用以下参数进行 30 个循环的实时 PCR 分析：95°C 初始变性 3 分钟，95°C 变性 30 秒，60°C 退火 1 分钟，72°C 延伸 1 分钟在 55–95 °C（以 0.5 °C 为增量）记录熔解曲线。2 -ΔΔCt方法用于计算相对倍数变化。实验中使用的引物序列见表  1  。

表 1 本研究中使用的引物对  

蛋白质印迹分析

HK2细胞用指定浓度的草酸盐处理，有或没有B. ligulata提炼。在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中收获细胞并在冰上匀浆。通过 6% 或 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离总共 30 μg 的蛋白质，并电泳转移到 PVDF 膜上。在室温下在 5% 脱脂牛奶中封闭 1 小时后，将膜与一抗在 4°C 下孵育过夜。然后将膜在 PBST 中冲洗三次，并与辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的 2° 抗体在室温下孵育 1 小时。最后，用增强的化学发光 Femto 蛋白质印迹试剂使蛋白质条带可视化。使用 image J 软件分析印迹。

统计分析

计算所有数据并显示为平均值±SD（标准偏差）。统计分析使用单向方差分析 ( p  < 0.05) 和双向方差分析 (ANOVA) 来估计值之间的差异，并使用 Graph Pad prism 软件版本 6.2 进行测试。

结果

B. ligulata的抗氧化特性

对B. ligulata乙醇提取物的总酚类和类黄酮含量的评估揭示了可能有助于抗氧化潜力的化合物的存在。提取物含有 83.5 ± 3.53 mg 总酚（mg/g 表示为没食子酸当量 (GAE)）和 72.23 ± 2.32 mg 黄酮类化合物（mg/g 芦丁当量）。通过DPPH 测定计算， B. ligulata提取物显示出显着的自由基清除活性，为 71.15 ± 2.61%。阳性对照 cystone 表现出相似的活性 (78.6 ± 2.27 + %)。

B. ligulata的保护作用是剂量依赖性的

为了研究B. ligulata是否可以保护肾细胞免受草酸盐损伤，将草酸盐损伤的细胞与不同浓度的提取物（10-1000 µg/mL）共同处理 24 小时。在台盼蓝活力测定中注意到对草酸盐损伤的保护性剂量依赖性作用直至 200 µg/mL，随后活力略有下降。由于 200ug/mL (80.66 ± 3.27%) 的提取物发挥了最大的保护作用，因此使用该浓度进行所有进一步的处理。

为了确认台盼蓝细胞活力测定的结果，我们进行了基于流式细胞术的 PI 测定（图   1A  ）。碘化丙啶是一种嵌入 DNA 的荧光染料。该测定基于 PI 染料不能渗透健康细胞膜的前提。如图   1B  所示，在 24 小时的处理期后，与草酸盐处理的细胞 (40.15 ± 2.62%) 相比，提取物能够将细胞死亡显着降低至 17.60 ± 1.27%。未经处理的对照 HK2 细胞含有 5.15 ± 2.61% 的死细胞，而在用线粒体膜电位破坏剂 CCCP 处理的细胞中观察到最大死亡 (86.0 ± 0.57%)。

图。1  

B. ligulata在草酸盐损伤的人近端肾小管细胞（HK2 细胞）中的细胞保护作用。使用 PI 染色进行细胞毒性评估的代表性图像以及通过流式细胞术可视化的B. ligulata提取物对草酸盐诱导的细胞死亡的影响。CCCP (10 μM) 作为细胞死亡的阳性对照。B该图显示了处理 24 小时后观察到的平均细胞死亡。** p  < 0.01, **** p  < 0.0001 表明细胞毒性相对于草酸盐的百分比存在显着差异  

细胞凋亡的评估

我们进一步评估了提取物是否可以减少与 HK2 细胞的草酸盐损伤相关的细胞死亡。受损细胞失去质膜的完整性并将磷脂酰丝氨酸（PS）从内膜转移到外膜，这是细胞凋亡的早期迹象。使用Annexin V-FITC/PI双染色-流式细胞仪方法，结果表明，在舌苔提取物共处理的细胞中，HK2细胞的早期和晚期凋亡程度均显着降低。如图   2所示  A，未染色和染色的对照组由于质膜完整而显示出最大的活力。草酸盐诱导的细胞损伤导致活细胞减少（30.10 ± 2.68%），早期和晚期凋亡细胞百分比增加（分别为 42.05 ± 5.02% 和 22.45 ± 1.90%）。B. ligulata提取物 (200 μg/mL) 的细胞保护潜力显着降低草酸盐损伤的影响，从而导致活力增加 (62.95 ± 3.46%) 和早期和晚期凋亡细胞百分比降低 (20.60 ±分别为 1.83% 和 12.95 ± 1.34%）。CCCP (10 μM) 作为线粒体膜电位丧失的阳性对照，导致晚期细胞凋亡的百分比很高 (78.95 ± 1.34%)。

图 2  

细胞凋亡评估A细胞凋亡通过Annexin V-FITC/PI（异硫氰酸荧光素/碘化丙啶）双染色检测。Q1(LL)、Q2(LR)、Q3(UR)和Q4(UL)四个象限分别表示正常健康细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和/或坏死细胞的百分比和坏死细胞，分别。数据是三个独立观察的平均值±标准差。ns p  > 0.05, * p  < 0.05, ** p  < 0.01, *** p  < 0.001, **** p  < 0.0001 与未处理对照相比；和# p  < 0.05，## p  < 0.01，### p  < 0.001，#### 与草酸盐处理的细胞相比，p < 0.0001。B EtBr/AO 生化染色检测到由于草酸盐诱导的损伤和用B. ligulata提取物共同处理的草酸盐损伤细胞引起的细胞结构变化。白色箭头表示正常健康细胞，黄色箭头表示早期凋亡细胞（亮绿色染色细胞），红色箭头表示晚期凋亡细胞（橙红色染色）。C.在草酸盐损伤的细胞中 caspase-3 酶的激活是由于细胞凋亡和B. ligulata提取物处理导致的荧光降低。数据是三个独立观察的平均值±标准差。** p  < 0.01, **** p  < 0.0001 与未处理的对照相比；和### p < 0.001, #### p  < 0.0001 与草酸盐处理的细胞相比  

EtBr/AO双重染色的结果显示了相似的图片（图 2B   ）  ，其中共处理减少了草酸盐损伤细胞的凋亡特征。吖啶橙 (AO) 是一种单色荧光染料，通过质子捕获进入细胞膜。未经处理的对照 HK2 细胞保留其结构，这由 AO 染料的均匀分布显示。草酸盐诱导的细胞损伤会导致膜解体，从而导致溴化乙锭 (EtBr) 的摄取。通过杂乱的细胞核和不均匀的橙色染色检测早期和晚期细胞凋亡。坏死细胞在其周围显示出不均匀的橙红色荧光。

接下来，我们测量了负责执行细胞凋亡特征的活性 Caspase 3 的水平。我们的研究结果表明，草酸盐处理可诱导 HK2 细胞凋亡。草酸盐损伤在提取物共处理的HK2细胞中被抑制（图2C    ）  。健康细胞含有无活性的 Caspase-3 酶同工型，而经历凋亡的细胞则显示存在活性 Caspase-3。Ac-DEVD-AMC 是一种合成荧光探针，用于量化凋亡细胞中的 caspase-3 活性。在草酸盐损伤的细胞中计算了 AMC 的荧光强度 (60231.0 ± 4252.54)，在与B. ligulata共同处理的细胞中，荧光强度急剧降低了 50% 以上提取（27427±2993.18）。CCCP (10 μM) 是细胞凋亡的阳性对照，导致酶的荧光出现峰值 (90922 ± 1501.9)。

B. ligulata减少草酸盐诱导的 ROS 过量产生

ROS的产生导致线粒体去极化和细胞凋亡的诱导。草酸盐损伤诱导自由基的产生，为了证实 200 ug/mL 的舌形草本提取物是否可以保护 HK2 细胞免受草酸盐诱导的氧化应激，我们进行了 H 2 O 2测定并估计了细胞内 ROS 的产生。  如图3A  所示 ，与正常条件相比，HK2细胞暴露于草酸盐24小时显着增加了H 2 O 2的产生水平。然而，当 HK2 细胞与B. ligulata共处理时，H 2 O 2的产生和细胞内 ROS 的产生显着降低提取物 (48.89 ± 0.67%) 与仅用草酸盐处理的细胞相比，因为它显示出最高水平的 H 2 O 2产生 (100%)。

图 3  

B. ligulata减弱草酸盐损伤细胞中细胞内 ROS 的产生。A由于用B. ligulata提取物共同处理草酸盐损伤细胞，导致细胞 H 2 O2 (%) 减少。*** p  < 0.001, **** p  < 0.0001 显示草酸盐处理细胞的显着变化。B活性氧清除活性以确定 DCFDA 通过草酸盐损伤的细胞产生的细胞内 ROS 以及它们与通过流式细胞仪测量的B. ligulata提取物的共同处理。C该图描绘了由于各种处理而产生的 ROS 的叠加图像  

基于流式细胞仪的测定使用细胞渗透荧光染料 DCFDA 来测量细胞内 ROS 的产生。DCFDA 被细胞酯酶切割并在过氧化物酶和 H 2 O 2存在下被氧化以产生荧光 2,7-二氯荧光素 (DCF)，并对其进行测量。图 3B 中显示的结果显示   细胞  内 ROS 生成显着减少。  该测定证实，与未处理的对照（35.2±1.69％）相比，草酸盐损伤（63.15±1.20％）细胞中的细胞内ROS阳性细胞群显着增加（  图 3B）。当草酸盐损伤的细胞与B. ligulata提取物共同处理时，注意到显着减少 (41.65 ± 1.62%)。

B. ligulata提取物减轻草酸盐诱导的粘附和 EMT 特征

为了观察对草酸盐损伤细胞的细胞毒性作用，对细胞晶体相互作用进行了显微镜研究。未处理的对照细胞的形态特征被发现是健康的，具有完整的细胞核。如图 4A 所示   ，  暴露于草酸盐并用 Hoechst 33258 染料染色的细胞在形态上发生了改变，出现了核碎裂和浓缩的染色质。草酸盐晶体诱导的HK2细胞损伤的影响显着降低了B. ligulata提取物。

图 4  

通过相位和荧光显微镜观察到的草酸盐损伤细胞的显微照片。A将暴露于草酸盐的 HK2 细胞与B. ligulata提取物共同处理，并计算 CTCF 强度。处理组：对照——未处理的 HK2 细胞；草酸盐损伤的细胞（2 mM）；草酸盐处理的细胞 (2 mM) +  B. ligulata提取物 (200 μg/mL)；草酸盐处理的细胞 (2 mM) + Cystone (200 μg/mL)，40x。插图在 60 倍放大倍数下显示了赫斯特染色的草酸盐损伤细胞的亮色细胞核。乙粘附在 HK2 细胞单层上的草酸盐晶体的 SEM 图像。草酸盐（2 mM）处理组晶体形态的代表性图像；具有刺入边缘的草酸盐晶体粘附在细胞上。用B. ligulata提取物 (200 μg/mL)共同处理的草酸盐晶体的形态调节和崩解。草酸盐处理的细胞 (2 mM) + Cystone (200 μg/mL)，放大倍数 ×380。SEM 的插图显示了在 2kx 的更高放大倍数下晶体在B. ligulata和 Cystone 提取物中的溶解。在相位显微镜下观察到的C H 和 E 染色图像。用草酸盐处理的肾上皮细胞具有从立方上皮到细长的成纤维细胞样表型的显着形态变化，显示出明显的 EMT 转变迹象。与共同治疗B. ligulata提取物 (200 μg/mL) 显着调节细胞结构至其原始形式  

扫描电镜下观察草酸盐结晶对肾近端肾小管细胞的有害作用。如图4B所示   ，  在暴露于草酸盐的细胞中观察到具有锋利边缘的细长六角形COM晶体。SEM 图像显示存在大量不同尺寸的 COM 晶体，它们粘附在表面上。与B. ligulata提取物共同处理通过钝化和溶解晶体结构来显着调节晶体结构。

通过相位显微镜观察了舌叶草提取物对草酸盐暴露后 HK2 细胞形态变化逆转的影响，并用 H & E 染色细胞。如图 4 所示，  C  草酸盐  处理 24 小时导致显着肾小管细胞的形态从上皮立方表型变为梭形成纤维细胞型。然而，用 200 µg/mL 的B. ligulata提取物共同处理显示了形态的恢复，这在 H 和 E 染色的细胞中很明显。

B. ligulata改变肌动蛋白细胞骨架的位置和组织

我们讨论了草酸盐诱导的改变肌动蛋白表达水平的氧化应激是否可以通过与提取物共同处理来调节。鬼笔环肽用于研究这些变化，这些变化使用共聚焦显微镜观察。有趣的是，与我们的其他结果一致，草酸盐损伤的 HK2 细胞中的肌动蛋白应力纤维是杂乱无章的，呈现出明显的凋亡细胞和 EMT 转变的特征。未经处理的对照细胞中的F-肌动蛋白丝组织良好，在细胞表面和细胞质之间伸展，细胞呈纺锤形。与草酸盐损伤组相比，与B. ligulata提取物（200 μg/mL）共同处理的细胞中的细丝似乎变得有组织且呈纺锤形，如在对照细胞中所见（图 3）。   5  ）。

图 5  

共聚焦激光扫描显微镜观察草酸盐处理诱导的细胞骨架变化。细胞核（蓝色）和细胞骨架（绿色，由 F-肌动蛋白表示）分别用 DAPI 和 FITC 缀合的鬼笔环肽染色。基于所有三组中绿色荧光的综合密度生成 F-肌动蛋白表达的强度图谱，用 CTCF 表示。处理组：未处理的对照-未处理的HK2细胞；草酸盐损伤细胞 (2 mM) 和草酸盐损伤细胞 (2 mM) +  B. ligulata提取物 (200 μg/mL)。这些图像是在 40 倍的放大倍率下拍摄的  

通过免疫荧光、实时 PCR 和蛋白质印迹分析评估炎症标志物

通过评估炎症标志物 OPN、p38 MAPK 和 NF-ĸB，评估了B. ligulata提取物对氧化应激 (ROS) 介导的炎症的改善作用。使用免疫细胞化学对 OPN、p38 MAPK 和 NF-ĸB 的标记表达进行量化。这些基因的水平在未经处理的 HK2 细胞中最低，而草酸盐处理显着增加了它们的表达，如图   6A   (a) 中的红色荧光强度所示。在用B. ligulata提取物共同处理的细胞中观察到这些标志物的表达显着下降。使用 Image J 软件通过图谱和 CTCF 强度图对表达水平进行量化。

图 6  

草酸盐晶体通过 ROS 介导的炎症诱导上皮细胞向间充质细胞的转化。通过免疫细胞化学检测炎症和 EMT 标志物的表达。免疫荧光染色分析暴露于草酸盐晶体的HK2细胞中TGF-β1、波形蛋白（绿色）和OPN、p38MAPK、NF-ĸb、E-钙粘蛋白（红色）的表达，细胞核用DAPI（蓝色）在×40下染色放大。B暴露于草酸盐的 HK2 细胞中 OPN、p38MAPK、NF-ĸB、TGF-β1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Occludin、Twist、Snail、Slug、Zeb1 和 Zeb2 的实时 qPCR 表达，* p  < 0.05 , ** p  < 0.01, *** p  < 0.001, **** p  < 0.0001 与未处理的对照相比；和#p _ < 0.05, ## p  < 0.01, ### p  < 0.001, #### p  < 0.0001 与草酸盐处理的细胞相比。C. _ Western blotting检测草酸盐暴露HK2细胞中p38MAPK、OPN、E-cadherin和Vimentin的表达水平，GAPDH作为上样对照；p38MAPK、OPN、E-cadherin 和 Vimentin 的条带强度通过 Image J 软件测量并用 GAPDH 标准化。ns p  > 0.05，* p  < 0.05，** p  < 0.01，与未处理的对照相比；和 ns p  > 0.05, # p  < 0.05，与草酸盐处理的细胞相比  

与未处理的对照相比，OPN (6.76 ± 0.36)、p38 MAPK (5.3 ± 0.10) 和 NF-ĸb (4.24 ± 0.52) 中由于草酸盐暴露导致的肾上皮细胞 mRNA 水平的倍数变化显着增加。与B. ligulata提取物共同处理的草酸盐损伤细胞的 mRNA 表达倍数变化对于 OPN 显着降低至 2.96 ± 0.09，对于 p38 MAPK 为 2.1 ± 0.1，对于 NF-ĸB 为 1.65 ± 0.21 [图。   6   B(a)]。

还通过蛋白质印迹评估了炎症标志物蛋白 OPN 和 p38 MAPK 的表达水平。草酸盐损伤细胞的 OPN 和 p38MAPK 的相对标准化表达水平分别为 1.16 ± 0.13 和 2.21 ± 0.22。由于用草酸盐损伤细胞的B. ligulata提取物 OPN (0.78 ± 0.04) 和 p38MAPK (2.0 ± 0.09)处理，蛋白质表达水平显着下降（图   6   C）。

通过免疫荧光、实时 PCR 和蛋白质印迹分析评估上皮和间充质标志物

为了进一步证实草酸盐诱导的 HK2 肾小管细胞中的 EMT 可以通过与B. ligulata的乙醇提取物共同处理来减少，进行了免疫荧光、实时 PCR 和蛋白质印迹分析以评估上皮和间充质表型的标志物. E-钙粘蛋白是上皮细胞的标志蛋白（E-钙粘蛋白），双染色免疫荧光测定结果显示皮质表达减少，而间充质标志蛋白（波形蛋白）同时增加。这通过与B. ligulata提取物的共同处理而逆转[图。   6   A(b)]。

通过定量RT-PCR评估所选EMT标记的基因表达变化，结果如图6B    （   b）所示。qPCR 分析显示 TGF-β1 (4.18 ± 0.45)、Vimentin (3.94 ± 0.48)、N-cadherin (2.25 ± 0.06)、Occludin (3.17 ± 0.27)、Twist (3.54 ± 0.26)、Snail (2.95 ±) 的表达升高0.49)、Slug (3.30 ± 0.24)、Zeb1 (2.48 ± 0.48)、Zeb2 (3.14 ± 0.31) 和由于草酸盐诱导的肾上皮细胞损伤导致的 E-cadherin (0.26 ± 0.02) 表达降低。舌形草共处理草酸盐损伤细胞的表达提取物表明 TGF-β1 (2.06 ± 0.19)、Vimentin (2.45 ± 0.21)、N-cadherin (1.32 ± 0.20)、Occludin (1.81 ± 0.36)、Twist (1.93 ± 0.19)、Snail 的基因表达显着下降(1.43 ± 0.03)、Slug (1.30 ± 0.29)、Zeb1 (1.59 ± 0.04)、Zeb2 (2.38 ± 0.34) 和 E-cadherin 表达增加 (0.82 ± 0.02)。

然后我们通过蛋白质印迹测量了E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达（图6C    ）  。结果表明，相对于对照 (1.63 ± 0.036) 和B. ligulata，在草酸盐损伤的上皮细胞中，间充质标志物 (vimentin-1.37 ± 0.25) 水平升高，上皮标志物 (E-cadherin-0.71 ± 0.29) 水平降低提取物 (1.06 ± 0.29) 逆转了这种作用，从而增加了上皮标志物 E-钙粘蛋白的表达。波形蛋白的表达在B. ligulata提取物 (0.90 ± 0.37) 处理的细胞中也降低，并且在对照细胞中最低 (0.66 ± 0.26)。

讨论

生物系统通过清除 ROS 的各种内源性酶和蛋白质保护自己免受自由基损伤。然而，降低的抗氧化水平或升高的 ROS 产生会导致氧化应激，然后是炎症损伤导致细胞损伤，以及各种病理状况的表现，包括肾结石或肾结石，最终导致器官功能障碍 [   29   ]。在患有草酸钙结石的患者的尿液中分析了对各种大分子（例如存在于肾小管细胞中的脂质和 DNA）的过氧化损伤的增加证据，这突出了 ROS 在结石病病理学中的作用 [   30  ]。肾结石病在 10 年内的复发率高达 60% 以上，而冲击波碎石等治疗方案会导致组织损伤，从而进一步促进晶体沉积增加，从而增加复发性结石形成的机会 [   31   ]。由于肾结石疾病的多因素性质，尽管在该领域进行了研究，但预防和管理结石病的有效疗法仍然有限。

肾脏含有各种大分子，可抑制钙和草酸离子的聚集，从而导致晶体形成，从而预防肾结石 [   32   ]。然而，如果结石促进剂和抑制剂之间的平衡发生倾斜，则会导致有利于结石形成的条件 [   33   ,   34   ]。肾细胞暴露于 COM 晶体通过调节细胞粘附效应分子的表达导致细胞与细胞和细胞与基质的粘附结合减少。然后，这会导致细胞内发生一系列关键事件，这些事件是由参与基因转录的各种蛋白质的调节所协调的，这些蛋白质导致炎症、活性氧的产生和 CaOx 晶体与细胞膜的粘附性增强 [   35   ,  36   ]。我们观察到，用乙醇提取物对 HK2 细胞进行共处理会降低 CaOx 晶体对细胞的粘附，同时增加活力，并减少凋亡细胞群。这些结果与我们之前对大鼠上皮肾小管细胞的研究一致 [   26   ]。

B. ligulata的乙醇提取物含有具有抗炎和抗氧化活性的化合物。我们之前对大鼠肾上皮细胞的研究表明，该提取物可调节晶体形态，减少氧化应激，并导致与舌形虫共同处理的草酸盐损伤细胞中的炎症介质（即 MAPK、OPN 和 NF-ĸB）减少[   26   ]。为了进一步阐明 B. ligulata在减弱导致结石形成的病理过程中的潜力，我们推测B. ligulata是否具有保护作用草酸盐损伤的人肾上皮 HK2 肾细胞上的提取物也可能有助于 EMT 的调节，这是肾结石多步途径中的重要参与者。因此，在这项研究中，我们研究了 EMT 过程中的各种参与者。

研究表明，CaOx 结晶会导致氧化应激，进而调节 EMT 和 ROS 的产生 [   37   ]。肾小管细胞使用各种细胞内信号通路进行交流，例如 TGF-β1、NF-kB 和 MAPK，它们也被认为可以调节 EMT [   38   ]。尽管有许多信号可以诱导 EMT 机制 [   39   ]，但 TGF-β1 和 NF-kB 已获得广泛关注，因为许多研究表明这些途径之间存在显着的串扰 [   40   ]。有鉴于此，对这一途径的调节可能会影响结石形成的过程。

草酸盐暴露于 HK2 细胞会导致 NF-kB 活性升高，导致包括 TGF-β1 和 OPN 在内的各种靶基因的转录。与此一致，在草酸盐暴露时诱导 TGF-β1 会导致通过激活 NAD(P)H 氧化酶产生 ROS，随后触发 EMT [   41   ,   42   ]。有趣的是，虽然 CaOx 损伤后肾脏中 TGF-β1 产生的主要来源是巨噬细胞 [   20   ]，但近端肾小管细胞（如 HK2）在暴露于 CaOx 时也会产生 TGF-β1 [   43   ]。由于 EMT，TGF-β1 已知可将肾小管上皮细胞转化为细胞外基质 (ECM)，从而产生成纤维细胞 [   44  ]。最近的研究报道了 p38 MAPK 在 TGF- β诱导的肌动蛋白细胞骨架重组中的重要作用，并在 TGF- β1诱导的肾小管上皮细胞 EMT 中充当重要的细胞内信号转导途径[   45   ,   46   ]。还已知活性氧可介导 TGF- β诱导的细胞反应，因此，主要通过激活 MAPK，但也间接通过磷酸化 Smad2 途径，在大鼠近端肾小管上皮细胞的 EMT 中发挥重要作用 [   12   ,   47   ]。

CaOx 晶体与 ROS 损伤的肾上皮小管细胞的粘附作为进一步聚集的病灶，并且几种类型的蛋白质参与了病理过程。骨桥蛋白 (OPN) 是一种基质糖蛋白，参与多种生理和病理过程，包括细胞粘附、迁移、信号传导、炎症和增加 CaOX 晶体聚集和粘附。此外，数据表明 OPN 与 CaOx 晶体共定位。OPN 的表达增加可能是由细胞损伤引起的 ROS 产生引起的，抑制氧化应激可能会逆转这种情况 [   48   ]。我们的结果还揭示了在B. ligulata之后 OPN 的表达降低这可归因于提取物降低活性氧产生的能力，从而抑制导致损伤的级联步骤。

越来越多的数据表明 TGF-β1 的显着参与，我们在目前的研究中已经证明，B. ligulata的提取物可能导致 ROS 水平降低，进而可能下调 p38 MAPK 通路和 TGF-β1。这种调节随后可能导致与 TGF-β1 诱导的 EMT 相关的各种转录因子 (TF) 的下调。EMT-TF，即 Snail、Slug、Twist、Zeb1 和 Zeb2。Snail 转录抑制因子家族通过与 CDH1 基因侧翼的各个区域结合在调节 EMT中发挥重要作用，该基因编码  E-钙  粘  蛋白  ，导致其  抑制  [   49、50、51、52、53  ]。Twist 1 属于 bHLH 转录家族，与SNAI2启动子结合并刺激其表达以诱导 EMT。在癌细胞中，TWIST1 抑制 E-cadherin 并在其他蛋白质的帮助下独立于 SNAIL 诱导 N-cadherin 表达 [   54   ]。ZEB1 和 ZEB2 作为转录抑制因子和激活因子发挥作用，并与CDH1基因两侧的 DNA 相互作用，抑制其启动子活性和上皮连接，从而降低细胞极性并激活间充质基因 [   55   ]。ZEB 表达是响应 TGF-β 和激活 RAS-MAPK 信号传导的生长因子而被诱导的。此外，TWIST1 与 SNAIL1 合作诱导 ZEB1 表达 [   56  ]。这些 TF 还抑制紧密连接中存在的连接分子（如 occludin）的转录 [   57   ]。EMT-TFs 的基因表达数据表明，在用提取物处理的 HK2 细胞中，这些 EMT 转录因子显着下调，这可能有助于 EMT 的逆转。因此，B. ligulata对草酸盐损伤细胞的共同处理可以下调这些转录因子的活性并消除对 E-cadherin 的抑制，从而导致其表达增加。我们的结果与此一致，正如我们所展示的B. ligulata乙醇提取物可通过增加 E-cadherin 的表达并同时降低间充质标志物 Vimentin、N-cadherin 和 α-SMA 的表达来防止草酸盐损伤。

通过肌动蛋白网络修饰进行的细胞骨架重排是 EMT 的一个重要标志，其中细胞骨架动力学发生了转变，导致从上皮表型转变为间充质表型 [   58   ,   59   ]。肌动蛋白在各种细胞过程中起着至关重要的作用，还负责维持细胞形态并影响细胞粘附和运动。报告表明，氧化应激的诱导可能通过肌动蛋白细胞骨架的改变导致细胞上存在的微绒毛破裂 [   17   ,   18   ,   60 ]  ]。据此，我们观察到草酸盐处理后肌动蛋白细胞骨架重组，表明 HK2 细胞中的 EMT 诱导，其中肌动蛋白细胞骨架的结构从扩散的肌动蛋白网络变为应力纤维，在与B. ligulata提取物共同处理后部分恢复.

植物中存在的天然化合物具有通过清除自由基的能力发挥抗氧化和抗肾结石作用的能力。白藜芦醇是一种酚类化合物，通过下调 ROS 的产生和降低炎症介质 MCP-1 和 OPN 的 mRNA 表达来保护草酸盐损伤的肾细胞 [   61   ]。草酸盐诱导的氧化应激导致细胞器损伤和微绒毛分解，而茶儿茶素 EGCG 主要通过清除自由基 [   20   ] 来防止这种情况。B. ligulata中存在大量重要的化合物，例如卑尔根素、角鲨烯、9-十八碳烯酸 (Z)-、甲酯和 aR-姜黄酮等可能是草酸盐损伤的HK2细胞发挥保护作用的基础。Bergenin 是B. ligulata提取物的重要成分，它可能负责抑制 EMT，因为它已被证明可以下调 TGF-β1 的表达 [   62   ]。此外，它还被证明可以通过抑制炎症和 TGF-β1 的产生来防止糖尿病模型中的肾损伤 [   63   ]。如我们的研究所示，降低的 TGF-β1 可能反过来导致 EMT-TF 的减少。角鲨烯是一种有效的抗氧化剂，可消除自由基引起的氧化损伤 [   64   ]。我们报道的另一种生物活性化合物存在于B. ligulata的乙醇提取物中可作为 NF-κB 的潜在抑制剂。在基于硅的对接研究中，9-十八碳烯酸 (Z)-甲酯已被证明与 NF-κB 相互作用，从而抑制其活性 [   65  ]。NF-κB 是一种由促炎信号激活的转录因子，在调节影响炎症级联反应的基因表达中起关键作用。在与提取物共同处理的细胞中观察到的 NF-κB 表达降低可能是由于存在 9-十八碳烯酸 (Z)- 甲酯，并且可能是由于提取物下调 NF-κB 表达并导致HK2细胞的活力增加。据报道，其他天然存在的代谢物如倍半萜内酯也可作为 NF-κB 信号级联的有效抑制剂。我们提取物中存在的 aR-姜黄酮也可以减轻炎症反应，  66   ]。类似的图片可能在我们的研究中发挥作用，从而赋予用提取物处理的草酸盐损伤的 HK2 细胞保护作用。报告显示 Snail、Slug、Zeb 1 和 2 等 EMT-TF 与上调的 NF-κB 表达之间存在直接相关性  [   67、68  ]。事实上，在生物信息学工具的帮助下，已经表明 NF-κB 与 EMT-TF 的启动子结合并调节它们的表达。因此，抑制 NF-κB 的表达会导致 EMT 的抑制。我们的结果与报道的文献直接一致，其中抑制 NF-κB 也与我们处理的细胞中 EMT-TFs 的表达降低有关. 此外，NF-κB 还通过增加间充质标记波形蛋白的表达来促进 EMT 过程 [   69   ]。我们通过基因和蛋白质表达分析得出结论，在与提取物共处理的细胞中波形蛋白的下调，这可能有助于抑制 EMT。

结论

据我们所知，本研究中提供的结果首次证明，B. ligulata可以以多管齐下的方式发挥作用并抑制结石形成过程中的各个步骤。通过抑制 EMT 的关键参与者，B. ligulata还可以保护暴露于草酸盐的肾上皮细胞（图   7  ）。鉴于这些发现，有理由认为，存在于B. ligulata提取物中的生物活性化合物下调氧化应激，进而导致作为影响 EMT 途径的转录因子的关键基因下调。然而，有必要在动物模型中进一步探索和验证，以提出有效的肾结石管理策略。

图 7  

提出的B. ligulata提取物对草酸盐损伤的肾上皮细胞的作用机制。通过下调参与结石形成多步骤过程的关键参与者，包括炎症、EMT 和细胞凋亡，B. ligulata有助于细胞保护潜力  

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