重磅科研丨Nature (IF: 69.5): 组合、加性和剂量依赖性药物-微生物组关联

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编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   在由健康状态过渡到心脏代谢疾病的过程中，患者需要大量药物治疗，这导致肠道微生物组和血清代谢组异常，并使生物标志物的发现变得复杂。本研究通过对来自MetaCardis队列的2173名欧洲居民的整合多组学分析，表明药物对宿主和肠道微生物组特征变异的影响超过疾病本身。作者量化了单一药物、它们的组合以及加性效应的推断效果，并表明后者将代谢组和微生物组转向更健康的状态，例如他汀类药物联合阿司匹林协同降低血清动脉粥样硬化脂蛋白，或利尿剂联合β-受体阻滞剂对肠道Roseburia的富集作用。几种抗生素在规定的疗程数显示出与与心脏代谢疾病严重程度相关的微生物组状态进展之间的定量关系。本文还报道了心脏代谢药物剂量、临床标志物和微生物组组成改善之间的关系，这一结果支持直接药物效应。综上，本研究的计算框架和由此产生的资源能够解开多种药物治疗个体中药物和疾病对宿主和微生物组特征的影响。此外，使用我们的框架确定的稳健特征为心脏代谢疾病中药物-宿主-微生物组相互作用提供了新的假设。    

论文ID

原名：Combinatorial, additive and dose-dependent drug–microbiome associations

译名：组合、加性和剂量依赖性药物-微生物组关联

期刊：Nature

IF：69.504

发表时间：2021.12

通讯作者：Karine Clément，Michael Stumvoll，Peer Bork

通讯作者单位：法国索邦大学；德国莱比锡大学医学中心；德国欧洲分子生物学实验室

DOI号：10.1038/s41586-021-04177-9

实验设计

结果与讨论

确定肠道菌群对健康和疾病的强劲贡献需要复杂的技术和统计技能，并且由于许多影响微生物组成和疾病的协变量仍然具有挑战性。常见的协变量包括治疗药物，如广泛使用的质子泵抑制剂（PPIs）和2型糖尿病(T2D)药物二甲双胍，它们影响肠道微生物群并调节炎症。此外，药物-微生物的直接相互作用已在体外得到证实。对于大多数健康人群中的几种药物，它们的使用解释的微生物群组成的差异比其他测试协变量更大，尽管个体效应较小。然而，对健康人群的研究不足以调查药物在慢性疾病中的副作用。为了从宿主和疾病因素中有力地解开药物-微生物组的关联，需要大样本量和高分辨率的临床表型和药物，同时考虑已知影响肠道微生物组的变量。最后，药物效应通常是剂量依赖性的，但在微生物组研究中很少考虑剂量。为了克服这些局限性，我们提出了一个通用框架，用于在多组学横断面研究中将疾病与治疗关联分开，并将其应用于来自多中心MetaCardis队列的2,173名欧洲居民的肠道宏基因组、宿主临床和代谢组学测量。MetaCardis队列包括患有代谢综合征、严重和病态肥胖、T2D、急性和慢性冠状动脉疾病和心力衰竭的患者以及健康对照个体。考虑到心脏代谢疾病(CMD)和此处常用的处方药，我们调查了8种主要适应症（抗糖尿病、抗高血压、抗血脂异常、抗血栓药、抗心律失常药、痛风药、PPIs和抗生素）的药物-宿主-微生物组关联。 最常用的CMD处方药物是他汀类药物（n=772, 35.5%)、β-受体阻滞剂 (n =656, 30.2%)、二甲双胍 (n=607, 27.9%)、阿司匹林 (n = 532, 24.5%)、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(n= 470，21.6％）和血管紧张素II受体阻滞剂（n=470，21.6％），通常是联合使用。因此，我们在可用的表型、饮食和人口统计变量、分子读数（包括脂蛋白、细胞因子和代谢物的血清浓度）以及肠道微生物组的分类和功能特征的背景下研究了个体药物效应及其协同和加性相互作用。 为了量化药物的整体效果，我们对药物、临床和环境因素以及疾病状态对宿主和微生物组的总影响数据进行了多元回归分析。所有这些药物加在一起解释的微生物组组成的变异比单独疾病组或保守估计下考虑的任何其他因素更多。然而，与先前报道的高个体变异性一致，模型中包含的因素只能解释1.7%-9%的个体间差异，其中1%-2.5%可归因于药物摄入，与疾病状态、饮食和吸烟的总和相当。

为了量化单个药物的作用，我们采用了单变量统计方法，从肠道微生物组和宿主特征的疾病关联中分离药物。因此，区分患者组与健康对照的特征分为：（1）确定的非混杂的CMD特征；(2)不确定的非混杂因素（与治疗和疾病密切相关）；(3) 混杂因素（明确的药物关联）。药物与微生物组或代谢组之间的大部分初始关联（例如，T2D为45%）归因于药物摄入(图1b和补充表5）。尽管如此，我们恢复了先前描述的代谢疾病的特征，并表明这些特征不能归结为治疗效果。因此，我们推断药物认知方法揭示了真正的疾病关联，并且对于避免生物标志物发现过程中过于夸大的治疗混杂假阳性至关重要。

图 1. CMD 药物、宿主和微生物组之间的关联。a由变量组和特征类型解释的变异 (R2 )。b T2D个体和对照个体之间差异丰富的特征进行混杂分析。数据是效应大小的分布；列举了每个类别的特征数量。绿色小提琴显示了按药物类别划分的混杂因素。c,与至少一个患者组中的每种药物相关的宿主（左）和微生物组（右）特征的分层聚类。特征分为潜在药物作用（与疾病关联不一致）和严重程度标志物（与疾病关联一致）。GC-MS，气相色谱-质谱联用；MGS，宏基因组物种；mOTU，宏基因组操作分类单元；NMR，核磁共振。d每个临床组中，阿司匹林使用和特征与疾病效应大小之间自信去混淆关联的效应大小（Cliff's delta）（左）。右，为便于解释突出显示了一个特征子集。Uncl.，未分类的。 随后，我们将药物的潜在直接影响（治疗关联方向与疾病关联方向相反）与潜在严重程度标志物（治疗和疾病关联的方向一致）分离。在至少一个患者组中不少于10人服用的28种心脏代谢药物中，发现抗糖尿病药物、他汀类药物、β受体阻滞剂、抗血栓药物和阿司匹林对血清代谢组的影响最强。尽管适应症相同的药物（即抗糖尿病药、抗高血压药）与宿主特征具有一致关联，但这些药物对肠道微生物组的影响在效应大小和方向上更加多样化（图1c）。我们的方法再现了以前报道的关于抗生素、PPIs、他汀类药物、β-受体阻滞剂和二甲双胍作用的研究结果。重要的是，我们确定了这些以及其他常用药物的新关联。例如，我们确定了与阿司匹林相关的微生物物种丰度变化，以及与改善心脏代谢健康相关的血清脂质组和代谢组的变化（其中Ruminococcus gnavus、Clostridium glycyrrhizinilyticum和微小微单胞菌Parvimonas micra减少，炎症标志物（CRP和IL-6）的血浆浓度降低，丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸的水平降低，其显著性与在用药个体血清中检测到的阿司匹林水平相当；图1d)。此外，γ-丁酰甜菜碱是最近发现的一种促动脉粥样硬化的微生物代谢中间体，在服用阿司匹林的个体中含量较低，揭示了该药物在已知的血小板抑制功能之外还有潜在的复杂抗动脉粥样硬化作用。对于二甲双胍，我们推断出新的抗糖尿病作用可能与谷氨酸水平降低有关( d = -0.17，FDR校正后的P = 0.02)，由于微生物谷氨酸转运减少（d =-0.2，FDR校正后的P = 0.006）以及微生物对维生素B12摄取增加（d  = 0.32，FDR校正后的P = 3.65 ×10-6），可能导致宿主维生素B12缺乏，这是二甲双胍的已知副作用。PPIs与肠道微生物组特征的关联最大，包括可能较高的口腔细菌流行率，这支持了由于胃酸降低，PPI引起的口腔细菌转移到肠道的假设。基于大型参考队列的单核苷酸变异分析显示，服用PPIs的个体肠道中口腔菌株如罗氏菌(Rothia)、嗜血杆菌(Haemophilus)和链球菌(Streptococcus)的丰度增加，这意味着随着胃酸的减弱，患者自身的口腔菌株在肠道中定植。

除了单一药物之外，MetaCardis还可以分析组合（多种药物）效应，因为有1300人被开了一种以上的药物（平均摄入3种药物，部分人每天服用多达13种不同的药物）。CMD中的多重用药主要反映了并发代谢性疾病、风险因素或预防动脉粥样硬化事件复发的治疗方法，但也包括为减少副作用而同时开具的药物，例如PPIs与阿司匹林联用以预防胃溃疡和出血。与仅服用一种药物的患者相比，服用多种药物的患者通常表现出更明显的疾病标志物方面的改善，这与药物间的协同作用相一致。在T2D组中，袢利尿剂对微生物组特征的协同作用最显著，尤其是与阿司匹林、ACE抑制剂和β-受体阻滞剂联用时，而他汀类药物对宿主特征的协同作用最显著（图2c）。例如，袢利尿剂联合阿司匹林、ACE抑制剂或β-受体阻滞剂更能增强微生物组相关的健康标志物，包括Roseburia丰度（联合使用d分别为：0.46、0.51、0.36；单药：利尿剂d =0.27）。与二甲双胍或阿司匹林一起服用时，他汀类药物与血清中较低的中密度、低密度(LDL)和极低密度(vLDL)脂蛋白水平和较低的总体脂质量相关，同时增加了T2D组中减少的厚壁菌门（Firmicutes）和产甲烷菌的微生物群落丰富度和丰度（图2d）。这些微生物组的变化可能介导对宿主的一些协同药物作用（图2e）。

图 2. CMD 药物的组合效应。a, 接受每种药物联合特定数量其他药物的CMD患者人数。b, 30种最常见的药物组合。节点大小与组合数量成正比。边缘宽度与每个组合的使用者数量成正比。线条颜色对应于显著药物关联的数量。实线表示药物对；点/虚线表示药物三联体。c，T2D患者中每种药物组合对宿主（底部，绿色）和微生物组（顶部，棕色））的影响强于单一药物的特征数量。对角线值表示每种药物单独影响的特征的数量。d, 2型糖尿病患者联合使用他汀类药物与二甲双胍、阿司匹林或钙拮抗剂的疾病关联（红色）、药物组合（黑色）和单一药物（其他颜色）的效应大小（Cliff's delta）。x轴上的每个项目对应一个药物组合特征关联。IDL，中密度脂蛋白。e，显示宿主和微生物组特征之间潜在中介作用的药物特征图。

接下来，我们调查了相加药物的关联。使用五年回顾性（疗程总数）的抗生素暴露观察到了最明显的关联。由于感染的增加，抗生素经常被用于CMD患者。然而流行病学研究将抗生素与肥胖、T2D以及代谢和炎症疾病的风险增加联系起来。在同组受试者中，既往抗生素使用史与较低的肠道基因丰富度显著相关（图3a；Spearman ρ  = -0.25，P=3.7×10-5)，并与肠道中抗菌素耐药基因的总丰度相关（对照个体：Spearman ρ=0.30，P =9×10-7；T2D个体：Spearman ρ =0.20，P = 2×10-5）（图3b)。这些发现表明在反复使用抗生素后，微生物群会发生累积性、叠加性转变，导致微生物群具有更强的耐药性但多样性减少，这是肥胖、胰岛素抵抗和轻度炎症中微生物组特征的标志。相同的特性将未使用抗生素的CMD患者与健康对照个体区分开来，证实了重复使用抗生素的影响（未使用抗生素的健康人群 vs. T2D患者的丰富度，双侧Mann-Whitney U (MWU) 检验，P = 7.9×10-21；抗生素抗性基因丰度，P =2×10-2)。使用主成分分析，我们表明微生物组组成的第一主成分解释了45%的变异并与基因丰富度相关，与抗生素的加性效应和抗生素暴露后的代谢损伤相关（抗生素效应：对照组Spearman ρ =0.27，P =1.7×10-5；T2D患者Spearman ρ =0.16，P =7×10 -4；未使用抗生素的健康个体与接受抗生素治疗的健康个体，双侧MWU检验，P =1×10-3；未使用抗生素的T2D个体与接受抗生素治疗的T2D个体，双侧MWU检验，P =1×10-3）（图3c）。这些变化的多元分解分析显示， Prevotella copri和Faecalibacterium prausnitzii的丰度降低，而Bacteroides vulgatus和Bacteroides dorei的丰度增加，它们代表了构成肠型特征的丰富属。此外，本研究还表明肠道微生物代谢功能的变化将特定抗生素组的加性效应与CMD易感性联系起来(扩展数据图5、7、补充表12和补充结果)。此外，MetaCardis中详细的药物追踪使我们能够研究剂量对宿主和微生物群的影响。对于具有充足剂量信息的20种药物，我们区分了剂量确定效应，即与药物摄入量及其剂量均显著相关的特征；以及剂量特异效应，剂量分析揭示了其他分析未捕获的相关性。通过剂量分析确定了特征最多的药物是二甲双胍、磺酰脲、胰岛素、PPI、痛风药物和他汀类药物，而二甲双胍和他汀类药物的剂量特异相关性最强（图3d）。他汀类药物的剂量与致动脉粥样硬化的vLDL水平呈负相关，突出了预期的剂量依赖性降脂作用，并与肠道中促进健康的Roseburia物种呈正相关。二甲双胍剂量与细胞因子水平（SDF1和MIF）呈负相关，这与之前关于其抗炎作用的报道一致。此外，我们观察到随着二甲双胍剂量增加，患者的Bacteroides 1和Bacteroides 2肠型的患病率发生了变化；所述Bacteroides 2肠型也与疾病相关，可作为与二甲双胍治疗无关的T2D严重程度标志物（图3e、f和补充表13和14)。对于他汀类药物，剂量分析加强了所报道的微生物组从Bacteroides 2 肠型转向更健康状态的观察结果。此外，剂量分析唯一确定了Bacteroides 2和Prevotella肠型鉴定作为严重和病态肥胖个体使用β-受体阻滞剂的严重程度标志物（图3e、f）。

图3.加性和剂量依赖性药物与宿主和微生物组的关联。a-c，对照个体（n =256）和 T2D 个体（n =456）中与过去 5 年抗生素疗程数显著相关的微生物组特征。a，基因丰富度；b，抗菌素抗性基因的总丰度；c，肠道物种组成的第一主成分。对于a–c，灰色区域显示线性回归的 95% 置信区间。箱线图（中位数（中心线）、四分位数（箱限）、1.5 倍四分位距（晶须）和离群值（点））显示了未使用抗生素（n =148（对照），n  = 274 (T2D)) 和抗生素暴露 ( n =108 (对照)，n =182 (T2D)) 对照个体和患T2D 个体。图中显示了成对显著性值（双侧 MWU检验，FDR 调整）。d，由剂量分析确定的药物特征关联数量(左)，或由剂量分析唯一揭示的药物特征关联数量(右)。从潜在药物效应（与疾病效应不一致）或严重性标志物（与疾病效应一致）中分离的特征。e , 各患者组内肠型分布中药物摄入效应大小 (Cliff's delta) 与药物剂量效应大小 (Spearman's ρ ) 之间的关系。在任一分析中受显著影响的特征（双侧MWU，FDR < 0.1）以绿色（潜在药物效应）或紫色（潜在严重性标志物）显示。黑色圆圈突出显示了f中描述的关联。Bact.拟杆菌；Prev，普雷沃氏菌；Rum，瘤胃球菌。f，彩色区域代表沿药物剂量轴堆叠的肠型流行率。每个点代表服用特定药物剂量的患者，并分为四种肠型之一。为获得更好的可视化添加了随机噪声（补充表11 – 14）。

结论

通过严格的分析方法，本研究表明在人体研究中需要捕捉的不仅仅只是药物摄入量，药物剂量、药物组合和抗生素使用史都应该纳入其中，以解开复杂疾病中的药物-宿主-微生物组相互作用。对于几种药物，我们的研究结果确定了与药物摄入相关的微生物组变化，这可能引起临床标志物的改善。考虑到观察性研究设计，我们的分析能够确定药物对微生物组和临床表型变化的相关（不一定是因果关系）影响。因此，需要在动物模型中进行实验验证（如低剂量阿司匹林的多模式效应，或者他汀类药物与阿司匹林或二甲双胍在喂食高脂肪饮食的LDL受体缺陷小鼠中的协同作用）来证实这一研究结果，因为在共患病人群中进行临床对照试验具有一定挑战性。如本研究所述，理清药物对肠道微生物组和血清代谢组的影响是理解药物在分子水平上的系统性影响的第一步，同时应进行临床前试验以评估其在CMD健康结果方面的意义。为了在遗传和微生物组变异以及复杂的药物治疗方案的背景下改善治疗效果，需要强大的分子标志物来识别从健康状态到慢性疾病的转变。随后，可以利用药物的肠道调节潜力进而以个性化的方式逆转疾病进展。 原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-021-04177-9 获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。

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