孙超主任团队解读：M2型巨噬细胞通过抑制坏死性凋亡-S100A9-坏死性炎症轴在慢加急性肝衰竭中起到保护作用

2019年肝病领域顶刊JOH指出，世界范围内每年大约有200万例患者死于肝脏疾病，我国约有700万肝硬化患者，每年新发肝癌46万，乙丙肝感染者逾1亿，为社会带来沉重的医疗和经济负担。

为契合《“健康中国2030”规划纲要》中提出的将重大慢性疾病过早死亡率较2015年下降30%的目标，肝胆相照平台与天津医科大学总医院消化内科联合打造“肝研撷萃”精品栏目。

“肝研撷萃”由天津医科大学总医院孙超主任担任总编辑，范晓飞博士、惠洋洋博士、王晓雨博士、崔膑心博士任执行编辑，通过研读分享各种肝脏疾病诊断、治疗、预防和发病机制的前沿进展，结合团队自身的工作，为广大医生提供精进学术、助力临床的交流平台。

“肝研撷萃”第十期，孙超主任团队对发表于Cell Death and Disease的一篇学术成果进行分享，以启迪临床。

研究背景

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指已有的慢性肝病短期内恶化加剧，通常发生在急性肝损伤后，目前发病机制尚不清楚。既往研究证实M2型巨噬细胞保护肝细胞免于凋亡，发挥护肝效应。

坏死性凋亡(necroptosis)已被证明与胚胎发育、组织稳态、免疫和炎症有关，与焦亡/铁死亡同属于调节性细胞死亡范畴。其执行依赖于受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RIPK)1的募集和去泛素化。坏死细胞释放包括S100A9在内的DAMPs，随后发生坏死性炎症。坏死性凋亡参与ACLF发病的机制有待进一步探究。

本研究将坏死性凋亡-S100A9-坏死性炎症轴的活化联系到ACLF的发病机制中，并假设M2型巨噬细胞通过抑制这一级联反应发挥保肝作用。通过应用特异性抑制剂证明坏死性凋亡和S100A9在D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤中的关键作用。

研究结果

结果1：坏死性凋亡的抑制可减轻急性肝损伤，伴随巨噬细胞的M2型极化

a、b：在坏死性凋亡抑制剂预处理后，D-GalN/LPS造模组显著升高的血清ALT和AST水平被抑制，肝脏组织病理学有所改善。

c：分析D-GalN/LPS造模组小鼠的巨噬细胞极化表型：急性肝损伤后，iNOS(M1标志物)表达增强，CD206(M2标志物)表达减弱。相反，在接受抑制剂预处理的小鼠中，iNOS的表达减弱，而CD206的表达增强。

结果2：肝纤维化抑制D-GalN/LPS引发的坏死性凋亡，依赖极化M2型巨噬细胞

a、b：D-GalN/LPS造模组小鼠肝组织中p-MLKL、MLKL和RIPK3蛋白及mRNA的表达显著增强，而纤维化小鼠肝组织中这些信号分子的表达明显减弱，即使在急性损伤条件下也是如此。

c、d：一方面，耗尽纤维化小鼠中的M2型巨噬细胞后，用D-GalN/LPS造模，RIPK3、MLKL和p-MLKL的表达明显增强。另一方面，将从纤维化肝脏中分离出来的M2型巨噬细胞过继转移到正常小鼠中，然后注射D-GalN/LPS，坏死性凋亡被显著抑制。

结果3：抑制S100A9减轻急性肝损伤，与巨噬细胞M2型极化密切相关

a、b：D-GalN/LPS处理后小鼠血清S100A9显著上调。但用RIPK3抑制剂GSK872或MLKL抑制剂GW806742X预处理后，S100A9表达显著降低。表明S100A9可能作为坏死性凋亡的下游信号传导分子。

c-e：生存分析表明：D-GalN/LPS造模组小鼠死亡率为87.5%(7/8)，而D-GalN/LPS+Paquinimod(S100A9抑制剂)组小鼠死亡率仅为23%(3/13)。接受Paquinimod治疗的小鼠血清ALT水平明显降低，肝脏组织病理学明显改善，证实了S100A9在急性肝损伤中的关键作用。

f、g：在Paquinimod治疗的小鼠中观察到了低表达的iNOS和高表达的CD206。M2/M1标志物的比值(CD206/iNOS、Arg-1/iNOS)提示巨噬细胞M2型极化。

结果4：S100A9在肝纤维化中表达受到抑制同样依赖M2型巨噬细胞极化

a、b：S100A9在急性肝损伤组织和外周血中显著升高，而在纤维化肝脏中其表达被显著抑制。

c-f：肝纤维化小鼠M2型巨噬细胞的耗竭消除了对S100A9的抑制作用，S100A9的表达显著增强；相反的，M2型巨噬细胞的过继转移则显著抑制S100A9的表达和分泌。

结果5：纤维化肝脏中M2型巨噬细胞抑制NLRP3炎症小体活化和坏死性炎症

a、b：NLRP3在急性肝损伤时显著升高，在肝纤维化时被显著抑制，提示肝纤维化对抑制NLRP3炎症小体激活起关键作用。

c、d：给予GSK872或GW806742X可显著抑制急性肝损伤时NLRP3表达；用S100A9抑制剂预处理后NLRP3的表达明显降低，表明NLRP3的激活是坏死性凋亡和S100A9介导的。

e、f：与坏死性炎症相关的信号分子在肝脏纤维化小鼠中也明显降低。

g、h：M2型巨噬细胞的耗竭和过继转移实验。与损伤后的纤维化小鼠相比，NLRP3、ASC和活化的caspase-1表达在巨噬细胞耗竭后显著增强；相反在M2型巨噬细胞过继转移小鼠中被显著抑制。

结果6：M2型巨噬细胞通过IL-10抑制体外坏死性炎症

a：体外条件培养基实验显示，TNF-α联合泛-半胱氨酸蛋白酶抑制剂(TNF-α/z-VAD[T/Z])能够诱导小鼠肝细胞坏死性凋亡。

b、c：将坏死性肝细胞的条件培养基孵育M0或M2型极化的小鼠巨噬细胞，M2型巨噬细胞NLRP3的mRNA和IL-1β水平明显低于M0巨噬细胞。

d、e：用IL-10抗体中和M2型巨噬细胞活化过程中分泌的IL-10，上述对NLRP3和IL-1β的抑制作用被逆转。

f-h：用重组IL-10刺激坏死性肝细胞来源的条件培养基孵育的M0巨噬细胞，外源性IL-10可恢复对NLRP3和IL-1β的抑制作用。

研究结论

坏死性凋亡的抑制与M2型巨噬细胞的极化密切相关，M2型巨噬细胞通过抑制坏死性凋亡-S100A9-坏死性炎症轴对ACLF起到保护作用。

NLRP3炎症小体的抑制作用依赖于坏死性凋亡途径和S100A9，同时肝纤维化通过极化M2型巨噬细胞抑制了这个反应过程。

体外实验证实IL-10介导了M2型巨噬细胞对坏死性炎症的抑制作用。

这一通路轴为今后针对ACLF的治疗干预提供了潜在的作用靶点。

主编点评

孙超主任✦

慢加急性肝衰竭（ACLF）是一种发生在慢性肝病患者中，表现为急性失代偿、器官衰竭以及高短期死亡率的临床综合征，多因酗酒、消化道出血、感染或者肝炎病毒再激活诱发。目前关于ACLF的诊断标准尚未达成共识，国际上提出的定义有13种之多，APASL和EASL-CLIF标准临床应用较多，前者强调显著黄疸、凝血功能异常，并发严重腹水/肝性脑病，而后者更加关注急性失代偿事件后序贯出现的器官衰竭。

最近发表的一项纳入迄今最大样本量的meta分析指出，ACLF在住院肝硬化患者中的患病率高达35%，平均90天死亡率高达58%。研究认为难以控制的全身性炎症(systemic inflammation)和免疫不全麻痹(immunoparesis)是其主要的病生理机制。而调节性细胞死亡，包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡可能是位于ACLF发生发展的上游分子生物学事件。

本期分享的文章有以下亮点：

1. 本研究首先利用经典的GalN/LPS体内动物模型，验证了RIPK3、p-MLKL介导的坏死性凋亡确实参与了急性肝损伤的发生，并进一步释放损伤相关的分子模式(DAMPs)S100A9诱发强烈的级联炎症反应。

2. 在前期工作的基础上，通过M2型巨噬细胞过继转移和耗竭实验证实了这一保护性作用在肝纤维化小鼠最为显著，极化的M2型巨噬细胞抑制NLRP3炎症小体释放和坏死性炎症。

3. 进一步的体外机制实验发现IL-10参与了M2型巨噬细胞对炎症反应的抑制作用。

展望：

目前针对ACLF并没有特异的治疗手段，主要包括支持治疗、处理急性诱发因素、预防并发症和肝移植。随着对其发病机制的逐步阐明，靶向ACLF进展过程中强烈难控的炎症反应，开发相应药物可能是行之有效的方案(例如TLR4信号转导抑制剂TAK-242、PAMPs拮抗剂重组碱性磷酸酶以及DAMPs拮抗剂恩利卡生等)。而本文和我们团队的研究都发现调节性细胞死亡可能是各种类型、不同程度肝损伤的早期分子生物学事件，对其进行有效干预无疑能够提升治疗效果、降低死亡率，值得进一步深入探究。

作者简介

孙明宇

天津医科大学临床医学专业，硕士研究生在读。以共同第一作者身份发表SCI文章2篇，目前研究方向为慢性肝病与体成分异常之间的关系，以及调节性细胞死亡在不同肝损伤中的作用机制。

通讯作者简介

孙超

副主任医师，本科毕业于北京大学医学部，天津医科大学医学/理学博士，日本兵库医科大学研究员。全国疑难及重症肝病攻关协作组成员，中国抗癌协会肿瘤肝脏病学专业委员会委员。主持完成国家自然科学基金一项。担任SCI期刊Journal of Clinical and Translational Hepatology编委、2021年度杰出编委，任职Portal Hypertension & Cirrhosis首届学术委员会，Frontiers in Pharmacology/Mediators of Inflammation客座编辑。2020年在EASL（欧洲肝脏研究学会）年会做口头发言，2021年在AASLD（美国肝病研究协会）年会做壁板展示。获得EASL的“Full Bursary”和APDW的“Travel Grant”奖励。以通讯作者在Clinical Nutrition, Liver International, Cell Death & Disease, Hepatology Communications等杂志发表SCI文章近50篇，他引590余次，h指数14，研究成果被ASGE（美国胃肠内镜学会）和EASL发布的临床实践指南引用。目前研究方向为调节性细胞死亡在急慢性肝损伤中的作用机制，体成分异常、营养不良、衰弱、睡眠障碍以及微量元素对肝硬化预后的影响及干预措施。

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