【醉翁之艺】CD8+ T细胞与神经元可逆性互作减弱衰老依赖性神经元再生

轴突再生与神经元功能性恢复在老年人群中极度受限。对老年人而言，神经系统损伤往往伴随着严重和长期的功能丧失。目前，关于衰老依赖性神经元再生异常分子机制的研究仍不足，来自英国伦敦帝国理工学院脑科学部神经科学系LUMING ZHOU等研究者们，对衰老导致的神经元恢复功能受损的潜在机制进行了探究，研究结果于2022年5月发表在Science杂志上。   
1. 衰老导致坐骨神经背根神经节在正常和损伤后适应性免疫基因谱发生广泛变化

图1 衰老导致背根神经节中趋化因子、细胞因子与适应性免疫相关基因表达上调 

实验小鼠分为4组：年轻对照组（Sham-Young）、年轻实验组（SNI Young）、老年对照组（Sham-Aged）、老年实验组（SNI-Aged）。首先，通过GO和KEGG对表达差异显著的基因进行功能分类（图1A）。老年小鼠背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）中适应性免疫反应，尤其是T细胞和趋化因子／细胞因子信号相关基因表达显著升高，而在受损之后进一步增加。根据GO和KEGG结果，使用富含免疫反应的310个转录本的候选名单来绘制假设的信号网络（图1B）
2. 老年小鼠DRG神经元CXCL13表达上调

图2 SNI前后DRG中的CXCR5+CD8+ T细胞表征

CXCL13是坐骨神经损伤（Sciatic nerve injury，SNI）后上调最显著的基因。CXCR5为CXCL13的受体，其表达同样在老年DRG中显著上调，表明存在CXCL13-CXCR5信号轴（图1C）。在SNI后3天，年轻和老年小鼠DRG中均可观察到CXCL13表达明显升高（图1D-H），表明其升高与年龄无关。   研究者进一步分析了小鼠SNI损伤3天后B细胞和T细胞的定位与免疫表型。在老年DRG中，CXCR5+ B细胞、CXCR5+CD8+ T细胞、CD4+ T细胞均显著升高（图2A-D）。在CXCR5+CD8+ T细胞中，多数为CD44+CD69+CD62L-，对应效应记忆T细胞；少部分为CD103+和P2RX7+，表明其主要为迁移而非组织驻留表型（图2E-F）。在老年小鼠中，CD8+ T细胞数量在DRG中显着增加，并且在SNI后3天进一步增加（图2G-H）。
3. 神经元CXCL13可招募CXCR5+ B细胞及T细胞至DRG中并修复轴突再生

图3 年轻小鼠DRG中过表达CXCL13可促进CXCR5+ B细胞和T细胞募集并减少SNI   
     

接着，研究者进一步探索过表达CXCL13能否募集CXCR5+B细胞和T细胞至DRG。利用腺病毒转染CXCL13至DRG中使其过表达，收集上清用于离体脾细胞迁移测定实验。实验证明过表达CXCL13可增强CXCR5  +   B细胞和T细胞的募集。此外，在体DRG中过表达CXCL13，发现CXCR5+B细胞和T细胞均显著增加（图3A-F）。坐骨神经元轴突再生在CXCL13过表达后显著降低（图3G-I）。因此，DRG神经元分泌的CXCL13可募集CXCR5+B细胞和T细胞并且能抑制轴突再生。
4. 坐骨神经损伤后衰老依赖性再生衰退依赖CD8+ T细胞和神经元MHC I

图4 SNI后衰老依赖性再生衰退依赖CD8+ T细胞和神经元MHC I 

随后，研究者探索DRG受损神经元的修复是否需要CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞或B细胞。对老年小鼠神经元损伤1周前给予CD8α抗体，可观察到神经元再生显著增加（图4A、C），而删除CD4+ T细胞或B细胞却没有影响，表明CD8+ T细胞参与了老年小鼠SNI后的再生衰退。RNA序列显示SNI后MHC I的表达存在衰老依赖性富集（图4B）。与年轻对照组相比，老年DRG神经元在SNI前后MHC I表达增加（图4D-F）。 研究者进一步探讨了衰老小鼠轴突再生下降是否需要MHC I依赖性肽呈递。使用AAV在老年小鼠坐骨DRG中条件性表达病毒编码的富含甘氨酸／丙氨酸的肽序列GAr，该序列抑制MHC I抗原呈递，从而避免CD8+ T细胞免疫反应。与对照组相比，可观察到GAr小鼠的MHCⅠ及caspase3表达显著下降（图4G-H）。AAV-GAr-rtTA转染后，小鼠坐骨神经轴突再生显著增强（图4I-J）。因此，在神经元受损后的衰老依赖性再生下降需要CD8+ T细胞与神经元MHC I。 研究者发现，在老年小鼠神经元受损3天后，cleaved-caspase3表达显著升高（图4K-L），且p-AKT和pS6与轴突再生有关并且通常会因衰老而受损。而且AKT和S6的磷酸化会在年老DRG损伤3天后降低，但删除了CD8+ T细胞后，该效应显著改变（图4M-N）。由此认为，年老DRG神经元损伤后，CD8+ T细胞依赖性激活的caspase3可抑制AKT和S6的磷酸化，抑制caspase3的激活可促进轴突再生。
5. 坐骨神经受损后CXCR5+CD8+ T细胞驱动衰老依赖的轴突再生减弱

图5 CXCR5+CD8+ T 细胞在SNI后导致衰老依赖性再生衰退

接下来，研究者评估了转染适应性CXCR5+CD8+ T细胞是否能抑制坐骨神经损伤导致的神经再生减弱。CXCR5+CD8+ T细胞大量浸润老年DRG，但不浸润年轻小鼠（图5A-B）。与老年小鼠相比，转移的CXCR5+CD8+ T细胞在年轻小鼠的脾脏中积累更丰富。这些CXCR5+CD8+ T细胞的迁移模式与DRG和脾脏中CXCL13的水平差异相关（图5C）。此外，转染CXCR5+CD8+ T细胞可显著降低老年小鼠坐骨神经元再生能力（图5D-E），导致老年DRG中穿膜蛋白的增高及pS6的降低，而对年轻小鼠则无影响（图5F-G）。
6. 拮抗CXCL13可阻断CXCR5+CD8+ T细胞的募集，缓解坐骨神经损伤后衰老依赖性轴突再生衰退

图6衰老DRG中CD8+ T细胞浸润和SNI后再生衰退依赖CXCR5

作者将野生型或Cxcr5-/- CD8+ T细胞转染至OT-I Rag2-/-小鼠，这些小鼠在 SNI 之前用对照免疫球蛋白G（IgG）或 CXCL13 mAb 处理。经CXCL13 mAb处理的Cxcr5-/- CD8+ T细胞在DRG中的募集及脾中数量相较于对照组显著降低（图6A-E、I、J）。拮抗CXCL13后，野生型坐骨神经再生显著增强（图6F-H），而在Cxcr5-/- CD8+ T细胞中无影响。以上结果表明，CXCL13 通过作用于其受体 CXCR5，是CD8+ T细胞迁移和限制老年DRG坐骨神经再生所必需的。
7. CXCL13中和逆转衰老依赖性再生衰退，促进坐骨神经损伤后神经功能恢复

图7 中和CXCL13增强老年小鼠SNI后轴突再生、表皮神经支配和感觉功能恢复  

最后，研究者对中和CXCL13是否能促进老年小鼠的轴突再生、表皮神经感觉以及功能恢复进行研究。注射CXCL13 mAb显著增强DRG离体培养中的神经突向外生长，减少CXCR5  +   T和B细胞的募集，并阻断老年小鼠SNI后3天坐骨神经的衰老依赖性再生衰竭和CD8  +   T细胞的DRG浸润，但对年轻小鼠没有影响（图7A-E）。在另一项实验中，作者测试了拮抗CXCL13对功能恢复的影响，发现老年小鼠恢复明显慢于年轻小鼠，并且在所有感觉模式的研究中，中和CXCL13诱导老年小鼠恢复显著加速（图7F-I）。中和CXCL13促进了老年小鼠后爪无毛指间区域的皮肤神经再支配（图7J-K），提示中和CXCL13促进老年动物的轴突再生、皮肤神经再支配和功能恢复。

醉翁之艺点评

衰老本身可导致细胞在细胞信号、代谢、免疫、基因调控和蛋白翻译等多种功能的改变，且会影响组织稳定。既往研究表明，衰老相关施旺细胞的去分化及激活损伤会限制受损周围神经系统的轴突再生，损害感觉和运动恢复。对小鼠受损后坐骨神经DRG进行RNA测序发现，衰老导致的免疫反应及细胞趋化因子升高，上调CXCL13的表达。CXCL13能够招募CXCR5+CD8+ T细胞，过表达MHC I。激活的CD8+ T细胞通过caspase-3依赖性减少p-AKT和pS6抑制再生信号，从而抑制感觉神经元DRG的轴突再生。在体实验中，敲除CD8+ T细胞或逆转CXCL13水平可重建轴突再生并促进功能恢复。本研究揭示了神经元与免疫细胞的互作可在老年人神经功能恢复中发挥重要作用。