科研 | Nature子刊：普通拟杆菌的蛋白酶与溃疡性结肠炎疾病严重程度相关

编译：微科盟亭亭，编辑：微科盟小编、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的一类，其主要的临床表现为慢性结肠炎症，粘膜炎症的严重性与持久性与患者的发病率及死亡率相关。UC的进程与宿主微生物群稳态失衡有关，但目前的治疗只针对宿主炎症通路。为了了解宿主-微生物群的相互作用在UC中发挥的作用，我们从40名UC患者中收集并分析了基于粪便或血清的组学数据集（粪便样本的宏蛋白质组学、代谢组学、宏基因组学、宏肽组学和扩增子测序图谱以及血清样品的蛋白质组学图谱），以及患者对应的各种临床疾病指标、内窥镜和组织学测量参数。另外还收集并独立分析了210个样本（73个UC患者、117个CD患者、20 个健康志愿者）的验证队列。两个队列的数据整合表明，一部分临床活跃的 UC 患者有过多的蛋白酶，这些蛋白酶来源于B. vulgatus。为测试B. vulgatus蛋白酶是否促进UC疾病进程， 我们首先分析了在患者和细菌培养物中发现的B. vulgatus蛋白酶。使用广谱蛋白酶抑制剂可改善B. vulgatus诱导的体外屏障功能损伤，并预防在IL10 缺陷小鼠中B. vulgatus 诱导的的结肠炎。此外，将具有高丰度 B. vulgatus蛋白酶的UC患者的粪便移植到无菌小鼠体内会诱导依赖于蛋白酶活性的结肠炎。

在对数据进行分析后，我们关注到一个通过多组学分析得到的发现，一些拟杆菌属的蛋白酶可能参与UC的发病机制。特别是多组学数据分析后显示拟杆菌（Bacteroides vulgatus）蛋白酶是治疗UC的潜在靶点。蛋白酶在之前就被认为是IBD的治疗靶点，但对微生物蛋白酶在疾病中的作用及特性的了解却不足。我们的多组学结果扩展且证实了最近的关于B. vulgatus与后期被诊断为UC患者的粪便蛋白酶活性相关。总之，我们的实验结果为抑制B. vulgatus蛋白酶可能预防和治疗UC提供了证据。

论文ID

原名：Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity

译名：溃疡性结肠炎肠道微生物组的多组学分析揭示普通拟杆菌的蛋白酶与疾病严重程度相关联

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

发表时间：2022.2

通讯作者：David J Gonzalez，Rob Knight

通讯作者单位：美国加利福尼亚大学

DOI：10.1038/s41564-021-01050-3

实验设计

结果

1 实验设计

  本研究收集了来自单一学术性 IBD 中心（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）的便利生物库的患者样本，这些样本利用多组学方法通过临床疾病活动指数和内窥镜、组织学严重程度的盲法评估进行了广泛的表型分析（补充表1）。我们的结果数据代表了迄今为止关于 IBD 患者最广泛的多组学资源之一，利用患者匹配的血清和粪便样本进行宏基因组和 16S rRNA 基因扩增子测序、代谢组学、宏肽组学、血清蛋白质组学和宏蛋白质组学分析（扩展数据图1）。收集初始研究小组40份UC患者的血清和粪便样本，随后收集了第二组210份粪便样本，其中包括 73例UC患者，117 份CD患者（CD；大致分为回肠、回结肠和结肠亚型）和20名肠炎的志愿者。我们先前建立的共享数据库经过组装和量化后综合宏基因组-宏蛋白质组学的方法用于微生物基因和蛋白质之间的直接比较。与传统的无标记宏蛋白质组学方法相比，我们的多重化宏蛋白质组学方法的应用提供了每个样本更多的蛋白质鉴定和超过10倍的量化的蛋白质。我们通过与从人类微生物组计划的 IBD 多组学数据库下载的数据进行比较来证明这一重要的技术优势，人类微生物组计划的 IBD 多组学数据库明显小于本研究队列的患者群体（扩展数据图2）。

2 IBD 严重程度的多组学相关性

尽管我们的队列代表了不同的患者群体（补充 表 1），但许多临床严重程度指标显示出高度相关性 （图 1 a ）。鉴于严重程度指标的重叠，一个代表性指标包括患者症状、UC 的 Mayo 评分 ，以及来自 CD 患者 的克罗恩病活动指数 (CDAI) 的报告结果（大便频率、腹痛、总体健康状况）被选中。在收集的所有 多 组学中，疾病严重程度与α多样性和β多样性均显着相关（ 图 1b,c，补充表2和 图 1a-f）。CD 亚型和两个单独处理的 UC 队列显示出与健康对照组不同的独特微生物群组成（ 图2 a 和补充 图 2）。我们观察到基于粪便的组学数据分布之间的相关性比血清蛋白质组 数据 更强（ 图 2b和补充 图 1g , h），并且 宏 蛋白质组 能 最强 预测 UC活性，紧随其后的是组合数据和代谢组（ 图 2c 和补充表 3）。与UC不同，CD  患者微生物组的一个有影响力的特征是肠杆菌科成员 占 优势 （扩展数据图3 ）。在患有活动性UC的患者中，我们还观察到人类蛋白质的增加，以及与活性相关的磷酸胆碱等代谢物类别（ 图 2d,e) 。

  图1多组学多样性与 iBD 疾病活动相关 。

a，临床数据之间相关性热图。对UC患者的临床指标之间的Spearman相关值进行分层聚类，确定密切相关的临床测量组。每个指标在x和y轴上以相同的顺序表示，并且仅显示y轴标签。b，α多样性随着 IBD 病情 活跃而降低。为每位患者基于16S数据的Pielou均匀度绘制，每 组 患者具有线性回归最佳拟合线和 95% 置信区间。R 2 值根据疾病活动、诊断及其相互作用来表示 。 c，β多样性与IBD 疾病 活动性相关。每个收集的组学数据集都由显示前两个轴的主坐标分析显示。每个样本都按疾病活动状态着色，并具有对应的形状来诊断。在考虑疾病活动、诊断及其相互作用时，Adonis R 2 值显示了疾病活动的影响大小 ， 显示了最能区分疾病活动的距离矩阵。显示的距离矩阵是每个数据集的加权 UniFrac，而不是使用Bray-Curtis距离度量的蛋白质组数据集和使用未加权 UniFrac的UC队列1的宏基因组。

图2 IBD 疾病活动的多组学分析。

a，按疾病活动状态划分的16S细菌门类组成。患者样本组的平均门组成以条形图显示。条形图表示 UC 队列1的样本大小为 n = 18、12、10；UC 队列2的 n = 34、9、13；结肠 CD n = 19, 8, 1；回结肠 CD n = 22, 7, 3；回肠CD n = 19, 4，2（分别为低、中和高活性）；n = 15个健康对照样本。b, 数据类型相关性。数据类型之间的 Pearson 相关性显示在热图中。Bray-Curtis 距离度量用于所有数据类型，并且使用 Mantel 检验在距离矩阵上计算相关性。c，评估预测 UC 疾病活动的多组学数据。对每个UC队列进行n = 100次随机森林分析迭代的均方误差训练分析预测部分Mayo疾病活动指数（从0-9），显示在从最强预测能力（宏蛋白质组）到最小预测能力排序（血清蛋白质组）的箱线图。

箱线图由中位数、四分位数和 1.5×四分位数范围定义。d，疾病活动状态的元蛋白质组组成。人类和微生物蛋白质的相对丰度按疾病活动状态进行平均，并按不同的患者类别绘制。条形图表示 UC队列1的样本大小为 n = 18、12、10；UC队列2样本n = 38、11、14；CD，n = 66、 31、9（分别为低、中和高活性）。e，与 UC 疾病活动相关的顶级代谢物类别。对化学类别求和的代谢物丰度进行平均，并对疾病活动进行线性回归。前10个正（上）和负（下）相关的化学物质类别的r值按诊断和队列绘制，并按来自UC队列的总r值的顺序显示。

利用微生物群基因和蛋白质的直接比较, 线性回归确定了与临床疾病严重程度最相关的特征 (r > 0.3)。比较正负关联的属注释确定拟杆菌属蛋白质占与 UC疾病活动正相关的蛋白质的40-60%（图3a和扩展数据图4）。疾病活动与拟杆菌属之间的这种关联在两个UC队列中得到证实，并被确定为UC所特有的，因为CD亚型各自呈现疾病相关蛋白的独特特征（扩展数据图5）。

宏基因组在很大程度上反映了宏蛋白质组中确定的关联的属水平偏差的方向和幅度；然而，与宏蛋白质组相比，拟杆菌属基因与 UC中高疾病严重程度的关系较弱（图3b 和扩展数据图4）。对与疾病活动相关的拟杆菌属蛋白质的功能分析显示酶家族的表达增加，更具体地说，蛋白酶（图3c）。B. vulgatus 和B. dorei，两种密切相关的物种，在健康成年人中普遍存在，在 UC 患者的宏基因组拟杆菌属中约占40% （图3d）。我们接下来分析了源自59种拟杆菌的119种不同酶和蛋白酶与 UC 严重程度的相关性。丝氨酸蛋白酶，包括6种二肽酶，是常见的拟杆菌属中与 UC 活性相关的蛋白酶之一（图3e）。

应用异常值方法比较宏基因组和宏蛋白质组数据，我们确定了B. vulgatus 和 B. dorei蛋白酶产量过多或不足的患者样本，并且观察到与蛋白酶减少组和典型的UC患者相比，蛋白酶增多的患者具有更高的临床严重程度和内窥镜活性（图3f 和扩展数据图6a）。从组织学角度来看，仅 18.8%患者归类为“过度”生产者处于组织学缓解状态，而 38.5% 归类为“生产不足”的患者和 45% 的所有其他患者处于组织学缓解状态（扩展数据图 6b）。由于一些相关的蛋白酶包括丝氨酸和金属蛋白酶（主要在细胞外空间发挥作用的蛋白酶类），我们假设这些蛋白质可能在细胞外蛋白水解和疾病活动的恶化中发挥作用。 

图3综合宏基因组-宏蛋白质组学分析揭示了拟杆菌属蛋白酶区分一类活动性UC患者。

a，与疾病活动相关的蛋白质分类偏差。对每种量化的蛋白质进行针对疾病活动的线性回归，并按患者队列绘制所有高度相关蛋白质的分类起源（Pearson值r > 0.3 或 r < -0.3）。b，在MG 或 MP 水平上高度相关的微生物开放阅读框的分类起源的偏差比较。线性回归如在a中进行，正相关 (r > 0.3) 和负相关 (r < -0.3) 中分类群的百分比表示通过 log10转换绘制。c, 在活动性 IBD 期间的拟杆菌中的功能转变。将来自a的与疾病活动相关的拟杆菌属蛋白质 (r > 0.3) 与其余已鉴定的拟杆菌属蛋白质进行比较，以确定与UC疾病活动相关的假定功能变化。d，UC 患者MG中拟杆菌属的物种水平调查。

拟杆菌属物种组成图显示了UC疾病活动类别，以及每个队列中的平均值。每个组成图上方是点图，表示 MG 中的拟杆菌属读数的平均丰度，或显示 UC 队列中一般分布的核密度估计的小提琴图。数据是根据 UC 队列 1 样本n = 18, 12, 10 和UC队列2样本n = 38, 13, 13 的样本大小编制的（每个分别排序低、中和高活动）。e，拟杆菌属蛋白酶和酶类与UC疾病活动的相关性。在热图中比较了在不同拟杆菌属物种中鉴定的蛋白酶的物种水平注释，显示了每种酶与每个样本的UC活性的相关性。f，拟杆菌属蛋白酶过度产生的患者与疾病活动增加相关。

采用异常值方法将 B. vulgatus 和 B. dorei宏基因组丰度与来自B. vulgatus和B. dorei蛋白酶的总蛋白质丰度进行比较，以确定具有高于或低于宏基因组预期蛋白酶存在的UC患者组。袋状图显示有一条最佳拟合线和生产过剩或生产不足状态由最佳拟合线上方或下方的异常状态确定。过度生产者、生产不足者和其他UC患者的疾病活动分别绘制在箱线图上。双侧t检验P值显示在箱线图上方。样本量包括n =16、14和77，分别代表过度生产者、生产不足者和其他人。箱线图由中位数、四分位数和 1.5×四分位数范围定义。

3 分析UC患者组学和拟杆菌属上清液中的蛋白水解

代谢组学和元肽组学分析证实了蛋白水解在 UC 患者中的重要性。最初是通过将二肽鉴定为与 UC 疾病活动具有第二相关性的代谢物类别来观察发现的（图2h 和4a）。二肽和寡肽是与疾病活动呈正相关（r > 0.3）的代谢物中最常见的两个化学物类别，分别占总正相关的 44% 和 5.8%。为了进一步分析寡肽，采用从头测序方法来分析元肽组（来自复杂的多物种样品的肽）。结果在重度UC 患者粪便样本和拟杆菌蛋白酶过度产生的患者中发现了更多的肽片段（图4b 和扩展数据图7）。数据还确认了来自人类蛋白质的肽片段，包括来自胶原蛋白和粘蛋白的结构蛋白（图4c）。

这些蛋白质代表了 UC 中蛋白酶的潜在靶标。中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶-3 的已知切割模式在已知肽的末端之间不属于强信号（扩展数据图7b），表明中性粒细胞蛋白酶可能不是患者蛋白水解的主要来源。与来自 UC 患者粪便和血清的疾病活动相关的t宿主蛋白的网络分析强调了蛋白水解的调节是一种常见功能（补充图3）。

为了表征存在于我们确定为与  UC 疾病活动相关的拟杆菌属物种中的蛋白酶活性，通过蛋白质组学和蛋白酶活性测定分析细菌培养物 的 上清液。抑制丝氨酸蛋白酶是破坏 B. vulgatu s 上清液蛋白质水解的最有效方法 （图 4d）。蛋白质组学分析发现丝氨酸型活性是 B. vulgatus 、 B. dorei 和 B. thetaiotaomicron（B. theta） 上清液蛋白质中最常见的酶功能类别（补充 图 4a）。接下来通过与 B.theta 相比 ，   B. vulgatus 的上清液中增加的丰度对鉴定的蛋白酶进行排序（补充 图 4b），然后通过 UC 群组中的总相关值进行排序（ 图 4e）。此外，比较了与UC患者相关的拟杆菌属蛋白酶的特性和在拟杆菌属上清液中发现的那些 蛋白酶 （补充 图 4c和 表 4）。  

图4评测UC患者和拟杆菌属上清液中的蛋白水解。 

a，二肽的丰度随着疾病活动的增加而增加。标注为二肽的代谢组学特征的每个样本平均相对丰度是根据疾病活动度绘制的，每个患者队列显示线性回归最佳拟合线和95%置信区间。b，在活动性UC期间肽片段更丰富。通过从头肽组学工作流程鉴定的肽数量与UC疾病活动指数绘制相关图，UC 队列1显示了具有95%置信区间的线性回归最佳拟合线。c，来自人类蛋白质的肽片段的数量表明UC蛋白水解的潜在目标。最常从粪便样本中的短肽中鉴定出的人类蛋白质的基因符号显示在 y 轴上，肽的数量显示在log10-转换后的x轴。蛋白质由观察到的蛋白质的常见类别着色。d，B. vulgatus上清液中的蛋白酶活性类别。在存在不同种类的蛋白酶抑制剂的情况下，对来自 B. vulgatus过夜培养物的浓缩上清液进行蛋白酶活性测定。载体对照用于确定每种抑制剂的抑制百分比和平均值±sem，每个条件从 n = 11孔中显示n = 3个独立实验。

蛋白酶抑制剂包括10 mM AEBSF（丝氨酸）、100 μM E-64（半胱氨酸）、2.5 mM GM6001（Metallo）和 180 μM Pepstatin A（天冬氨酰）。e，B. vulgatus蛋白酶通过与UC疾病活动相关性的总和排名。将UC疾病活动与B. vulgatus和B. dorei蛋白酶之间的相关值 (r) 相加，显示了排名前10 位的蛋白酶的总和，每个条形的颜色代表蛋白酶类别。

4 蛋白酶抑制可在体外和体内防止 B. vulgatus 诱导的结肠上皮损伤

接下来，我们使用 Caco-2 上皮单层测试了 UC 中 6 种 最丰富的拟杆菌对肠道屏障的影响。我们的结果显示，在与 2 种 最丰富的拟杆菌属物种 B. vulgatus  和 B. dorei  孵育38小时后，跨上皮电阻 (TEER) 显 著 降低，而其他物种则增加了 TEER（扩展数据 图 8a） 。虽然   B. vulgatus  和 B. dorei  对 TEER 有类似的影响，并且两者都有许多与 UC 疾病进程 相关的蛋白酶，我们选择将实验重点放在 B. vulgatus 上，因为它是 UC 患者 肠道微生物群和健康肠道微生物群中更丰富的成员。我们接下来通过添加蛋白酶抑制剂混合物 （针对丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶） 来评估蛋白酶活性对破坏上皮通透性的 影响。我们发现在接种 B. vulgatus   抑制蛋白酶 22 小时和38小时 后 均 显 著 增加 TEER（调整 P 值 < 0.0001，eta 2 = 0.64， 图 5a,b）。 该表型 不是 受 细菌生长或活力的影响，因为 B. vulgatus 的菌落形成（ c.f.u.s ） 在使用或不使用 蛋白酶抑制剂混合物处理没有明显差异（调整 P   值 = 0.98， 图 5c 和扩展数据 图 8b)。我们进一步测试了来自 B. vulgatu s 在对数生长期 时的 上清液是否对 TEER 有类似的影响 （ 扩展数据 图 8 c ) 。没有出现显著的影响，表明不管感兴趣的蛋白酶是膜结合性还是压力生成型的（如宿主和微生物相互作用或营养剥夺）都是蛋白酶分泌所必需的。

肠道单层的共聚焦显微镜显示B. vulgatus处理的上皮细胞有显著影响，紧密连接蛋白、Zo-1 和 Occludin 有明显改变（图5d 和补充图5）。成像研究还证明了对用B. vulgatus处理的 Caco-2 细胞的细胞形态和肌动蛋白网络的潜在影响（补充图5）。对单层细胞形状的分析显示出显着的细胞圆形度的降低（P = 0.0043），这可以通过蛋白酶抑制来恢复（图5e）。

为了研究B. vulgatus蛋白酶在体内的作用，我们在 IL10−/−无菌小鼠模型中用B. vulgatus进行了单菌定殖，将一般老鼠的饮用水用我们选择的蛋白酶抑制剂混合物补充（图5f）。定殖10周后蛋白酶抑制对结肠上皮细胞具有保护作用，减少隐窝的炎症细胞浸润（图5g）。蛋白酶抑制剂治疗显着改善了组织学结肠炎的严重程度（调整P 值 = 0.0061，图5h)，伴随着B. vulgatus引起的隐窝增生显着减少（调整P 值 = 0.0028，图5i）。宏观特征，例如小鼠的结肠长度，没有显着差异（补充图6a-h）。进一步，肠系膜淋巴结的免疫细胞谱显示CD4+、Th1、Th17 和 Treg 细胞群之间没有显着差异（补充图6i-l和图7）。在这项研究中，我们无法评估蛋白酶处理在多大程度上反映了与非蛋白水解拟杆菌定殖的小鼠相似的状态，因为该对照组不包括在内。

5 UC 患者粪便中存在的B. vulgatus蛋白酶在移植到无菌小鼠后会导致结肠炎的严重程度

接下来，我们评估在 UC 患者中高水平的B. vulgatus蛋白酶对肠道炎症发展的影响程。为此，我们将 UC 患者的粪便移植到易患结肠炎的 IL10 缺陷的无菌小鼠中（图5j）。我们选择了2组是否含有高水平B. vulgatus 蛋白酶的患者粪便样本（每组3 名 UC 患者），用于移植到易患结肠炎 IL10 缺陷的无菌小鼠中。这些小鼠中有一半通过饮用水给予蛋白酶抑制剂混合物（每种组9 只小鼠）。根据疾病的两个总体指标（结肠缩短和脾肿大情况，图5k,l）和组织病理学分析（图5m），给予富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出明显的结肠炎。这些表型在接受缺乏大量B. vulgatus 蛋白酶的 UC 患者粪便的小鼠中并不明显。在其他器官上未观察到显着差异（扩展数据图9a-f）。蛋白酶抑制剂混合物在给予低蛋白酶粪便样本的小鼠中这些参数没有显著影响，但显著减轻了接受富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出的结肠炎。

通过测量粪便载脂蛋白丰度和脾脏细菌负荷来评估结肠炎症显示出相似的程度，但未达到统计学意义（扩展数据图9g，h）。这些研究表明，拟杆菌属蛋白酶增加的 UC 患者的微生物群具有较高的致结肠潜在性，并表明蛋白酶抑制可作为严重UC的治疗干预方式。

最后，为了确认粪便移植研究中存在B. vulgatus蛋白酶，对小鼠粪便进行了宏蛋白质组学分析。将移植一名富含B. vulgatus 蛋白酶患者样本的小鼠的粪便与移植了一名低蛋白酶对照患者样本的小鼠粪便进行比较，无论是否存在蛋白酶抑制剂混合物，我们都能从移植富含蛋白酶患者样本的小鼠中检测到升高的拟杆菌属蛋白质和B. vulgatus蛋白酶，（扩展数据图9i 和图5n）。在这些小鼠中从 B. vulgatus 鉴定出来的蛋白酶的共同功能包括丝氨酸型肽酶活性和二肽酶活性（扩展数据图9j）。为了指导未来对B. vulgatus蛋白酶的研究，对UC患者中含有蛋白酶的特性、以及蛋白酶体外研究和体内研究之间进行了比较（扩展数据图9k、1 和补充表4）。值得注意的是，在整个研究过程中一致地鉴定了几种二肽酶（例如， DPPIV、DPPVII）。

这些肽酶在营养受限区域的氨基酸代谢和牙龈卟啉单胞菌（一种与牙周病有关的细菌）的毒力中发挥作用。有趣的是，人类 DPPIV 是众多用于治疗糖尿病疗法的目标。DPPIV 抑制剂还显示在结肠炎模型中具有保护作用（归因于能抑制胰高血糖素样肽-2降解），因此我们推测B. vulgatus DPPIV可能作为潜在的治疗靶点。

图5抑制蛋白酶活性在体外和体内保护免受B. vulgatus和粪便移植诱导的病理损伤。

a，使用Caco-2 细胞单层和拟杆菌属相互作用的体外研究的示意图。b，蛋白酶被抑制后显著恢复与B. vulgatus共培养的Caco-2上皮屏障功能。绘制了TEER随时间的变化图（平均值± s.e.m）。c，蛋白酶抑制剂混合物在Caco-2与B. vulgatus共培养期间不会显著影响c.f.u.s的数量，每个独立的实验显示的结果是平均 c.f.u.s ± s.e.m。Two-way ANOVA 调整了在14小时（P = 0.69）和38小时（P = 0.97）的数据并进行多重比较。来自b和c的数据是重复3次的独立实验，其中包含每个条件3个生物重复。 d，来自transwell实验的共聚焦显微镜的代表性图像，显示了未经处理的B. vulgatus和B. vulgatus + 蛋白酶抑制剂 (PI) 鸡尾酒组合的代表性图像，显示紧密连接蛋白、Zo-1 和 Occludin 以及 DAPI 的免疫荧光。

每个图像的下方和右侧是XZ 和YZ切片。比例尺，20 μm。e，来自面板d的图像中细胞圆形度的量化。双侧 t检验P值显示在组之间统计，统计数据来自n = 151（未处理）、221（B. vulgatus - PI）和 198 (B. vulgatus + PI)超过1 次独立实验的细胞。箱线图由中位数、四分位数和1.5×四分位数范围定义。f，单克隆IL10−/−小鼠研究的实验设计。给小鼠接种B. vulgatus，在 10 周的定植期间，通过给接种B. vulgatus 小鼠的饮用水连续添加 PI 鸡尾酒抑制剂。g，单一移植菌群小鼠的代表性H&E染色结肠切片。h，来自单克隆小鼠组织学评估的结肠炎评分。组间双侧t检验 P = 0.0061。i，单克隆小鼠的隐窝长度。组间双侧t检验P = 0.0028。h和i中的数据显示为条形图，平均值± s.d。实验数据来自n = 6动物的B. vulgatus – PI组和n = 8的B. vulgatus + PI 组，在两个独立实验中进行。j，人源化IL10−/−小鼠研究的实验设计。每组总共9只动物（除了8只小鼠用于高蛋白酶+ PI 组）代表每组3个UC患者样本在2个独立实验中进行了检测。 k–m，蛋白酶抑制可改善由UC粪便引起的结肠炎。

条形图显示为平均值± s.d.，针对结肠长度 (P = 2.6×10−7) (k)、脾重 (P = 3.3×10−5）（l）和结肠切片的组织病理学评分（P = 3.3×10−5）（m）one-way ANOVA的叠加P值分析。n，人源化小鼠粪便宏蛋白质组中蛋白酶的物种表征。对一组富含拟杆菌属蛋白酶的人源化小鼠和一组没有丰富蛋白酶的人源化小鼠的粪便样本进行基于 LC-MS3的宏蛋白质组学分析。基于每种蛋白酶的物种注释显示了鉴定的蛋白酶的相对丰度。

讨论

此研究中我们有效地收集 IBD 患者的广泛的多组学特征并将其转化为具有生物学和治疗价值的猜想。除了体外和体内验证外，通过整合粪便宏蛋白质组学、代谢组学、16S 基因扩增子测序、鸟枪宏基因组测序、宏肽组学和血清蛋白质组学，我们证明了微生物组的某些成员，例如B. vulgatus，可能通过蛋白酶活性促进UC 疾病恶化。此外，基于我们的体外和体内的实验结果显示拟杆菌属蛋白酶抑制剂可作为 UC 的潜在治疗方法。

为了证明我们的假设，我们利用了一些新的组学方法，例如我们基于比较宏基因组和宏蛋白质组数据的整合方法，以及肽片段的分析。鉴于现有的重要的IBD数据集包含了更多缺失值方法的蛋白质组学数据，我们有兴趣进一步研究基于我们宏蛋白质组数据发展而来的独有的发现。这些数据突出的一个引人注目的观察结果是，与UC疾病活动相关的约50%的微生物蛋白是来自拟杆菌属。虽然在微生物组研究中很少收集宏肽组数据，但这种数据类型提供了一个重要的补充工具，用于确定源自拟杆菌属蛋白酶的蛋白水解功能可能与 UC疾病活性相关。通过整合宏基因组数据，为我们的发现提供了基因组背景，并确定了用于体外研究的拟杆菌属物种。其他组学特征（血清蛋白质组学、代谢组学和16S）进一步证实了拟杆菌属蛋白水解功能作为 UC 严重程度的一个促成因素的核心假设。

我们的研究推进了目前对B. vulgatus和 UC之间联系 的了解。拟杆菌属是肠道中最丰富的物种之一，位于结肠的外粘膜层，在消化复合碳水化合物中起重要作用。早期研究表明B. vulgatus具有潜在的致病作用，因为发现该细菌在SPF级动物豚鼠中可诱导实验性的结肠炎。进一步加强这种联系是在 UC 患者中鉴定出针对B. vulgatus 外膜蛋白的高水平抗体。然而，后来的研究确定了B. vulgatus在结肠炎模型中的混合作用，最近的基因组研究只是偶尔涉及拟杆菌属。

因此，对拟杆菌在IBD中作用的详细机制尚未完全理解。我们的体外研究发现B. vulgatus和 B. dorei（它们是最近被重新归类到Phocaeicola属下的系统发育近邻) 破坏结肠上皮的完整性，此外，这种功能与丝氨酸和/或半胱氨酸蛋白酶有关。我们在B. vulgatus的移殖菌群动物研究和粪便移植研究中的结果发现来自B. vulgatus的丝氨酸蛋白酶在实验性结肠炎中发挥重要作用。在患者样本中，将B. vulgatus蛋白酶的丰度与B. vulgatus的宏基因组丰度进行交叉分析，使我们能够识别出一类细菌蛋白酶水平异常高的炎症患者。

有趣的是，最近的一项研究强调，B. vulgatus 蛋白酶的基因组存在以及粪便蛋白酶活性的增加与UC的发病有关。总之，我们的研究将B. vulgatus蛋白酶与疾病的开始和疾病活动的发作联系起来。此外，我们的研究现在表明，抑制B. vulgatus蛋白酶可能具有治疗或预防作用。

虽然细胞外基质重塑和蛋白酶活性变化是 IBD 中已知的事件，但细菌蛋白酶在IBD中的作用主要是靠推测。该领域的工作主要集中在宿主蛋白酶上，例如在 IBD 患者中减少的胰蛋白酶，或可降解常用的治疗药物的基质金属蛋白酶。一些作者估计，UC 患者中约27%的蛋白水解来自细菌蛋白酶。当小鼠使用抗生素降低了微生物组衍生的丝氨酸蛋白酶的活性时，进一步证明了细菌蛋白酶活性在胃肠道中的重要性。这里我们能够直接识别可能导致 IBD 的细菌蛋白酶的种类和特性。鉴于目前对 UC 的治疗主要针对宿主炎症通路，我们的研究结果代表了治疗的另一种方法。有趣的是，与最有希望的细菌蛋白酶类似的人体DPPIV 酶已经被认为是治疗开发的潜在目标。据我们估计，约 40%的UC患者（可能受益于细菌蛋白酶抑制的大部分患者）可能过度表达B. vulgatus丝氨酸蛋白酶。 

蛋白酶在拟杆菌中的作用仍然是一个未充分探索的研究领域。研究表明，它们的蛋白酶可能对宿主消化酶有影响，B. vulgatus的蛋白酶活性高于其他拟杆菌属物种。然而，对拟杆菌属蛋白酶作用的研究通常仅限于对来自脆弱拟杆菌的金属蛋白酶肠毒素的表征。在富含蛋白酶的拟杆菌中蛋白酶丰度的增加可能与细胞外膜囊泡有关。有趣的是，最近的一项宏蛋白质组学研究表明，细胞外囊泡与 IBD相关，据报道拟杆菌属蛋白是细菌细胞外蛋白的主要贡献者。我们假设UC患者肠道中的营养可用性或宿主-微生物相互作用可能会引发与UC活性相关的B. vulgatus蛋白酶的产生增加（扩展数据图10）。这些蛋白酶中的一种或其组合似乎能够破坏结肠上皮，这可能允许先天免疫细胞（例如中性粒细胞）流入，从而进一步加剧结肠炎。另一种假设是B. vulgatus携带独特蛋白酶，尽管我们认为这不太可能，因为我们的体外和体内研究使用的是从健康粪便中分离的B. vulgatus 菌株。

我们的研究中存在几个局限性。一个限制是我们在实验中使用了非特异性蛋白酶抑制剂，因此无法区分对我们的表型最重要的特定蛋白酶或蛋白酶类。其次，我们的单独移殖菌群研究不包括额外的对照组来比较蛋白酶抑制治疗后反映健康表型的程度。最后，我们在结肠上皮屏障上使用B. vulgatus上清液的实验并没有破坏在共培养中的膜完整性，强调需要更多的工作来确定我们观察到的表型的条件和机制。

这里显示的多维度多组学整合不仅是未来 IBD 多组学研究的重要资源，而且还作为一个例子展示了利用多组学数据整合进行验证猜想的发展。从对数百名 IBD 患者的广泛分析开始，并根据感兴趣的观察进一步完善我们的分析，从而在每个数据库为我们的假设提供了综合证据。我们通过大量体外和体内研究进一步缩小并验证了我们的主要假设，这些研究证明了蛋白酶功能抑制对预防B. vulgatus诱导的结肠炎的功效。总的来说，我们的研究突出了研究拟杆菌蛋白水解作用的重要性，并证明了来自B. vulgatus的蛋白水解功能可能与 UC 病理学和治疗有关。