详解：类器官分化研究的“金钥匙”!

关键词

iPSC疾病建模，肝脏类器官，中枢神经系统类器官，肺脏类器官，癌症类器官

从1910年，法国生物学家亚历克西·卡雷尔（1912年的诺贝尔生理学与医学奖得主）首次开创体外细胞的无菌操作、培养基更新、细胞传代，完善悬滴培养法开始，细胞体外培养技术已经走过了112年。

21世纪被认为是“细胞治疗”的时代，细胞治疗在肿瘤学、免疫学、神经科学等方面被给予厚望。而各类iPSC的开发研究则给细胞治疗时代按下了加速键。

时至今日，从2D的iPSC疾病模型研究到3D的iPSC“类器官”模型开发研究已经在再生医学、基因编辑、精准医疗、器官发育、疾病建模等方面表现出了良好的应用潜力。

“工欲善其事，必先利其器”。对于iPSC细胞2D和3D模型的建立，Gibco B-27作为最为常用的iPSC培养基添加剂，已有30年的应用历史，并助力研究人员发表了大量高分研究论文。

为了解决iPSC细胞培养难题，同时庆祝Gibco B-27应用30周年，我们选取了不同研究领域的经典文献来全面展现Gibco B-27添加剂在各类研究中的应用，为广大研究人员开展实验提供参考。

2D iPSC疾病模型研究

随着干细胞技术的发展，iPSC 已成为人类疾病建模的强大工具，在靶点发现和药物开发的转化研究中展现出巨大潜力。神经退行性疾病，如阿尔兹海默症(AD)已经逐步成为危害全球的一种慢性病。因此，使用iPSC构建AD疾病模型对于研究其发病机制和开发靶向药物都具有重要意义。

然而，传统的iPSC神经疾病模型构建都只能在短时间内完成，而AD发病群体一般都为老年人。因此，如何基于iPSC开发更长时间的AD疾病模型就显得十分必要。

Fig. A high-throughput, automated human iPSC-derived neuron differentiation and culturing platform[7].

2021年，在一篇发表于Nature communications的文章《Improved modeling of human AD with an automated culturing platform for iPSC neurons, astrocytes and microglia》中，研究人员使用赛默飞B27系列产品基于人类iPSC开发一种自动化、一致性好和时间持久的干细胞培养平台，使用该平台，研究人员开发了iPSC AD模型，该模型可以很好的模拟AD发生过程中的特征性变化，为今后研究AD提供了新的策略。  

3D iPSC 类器官研究

01

肝脏类器官

肝脏是机体调节许多生理过程的重要代谢器官，如糖原储存、脂质代谢、解毒功能等。肝脏的疾病、如肝癌、肝功能衰竭、肝代谢疾病等一直是全球排名靠前的致死性疾病。而传统的2D肝细胞体外培养无法再现体内肝细胞的结构、生理和功能特征，因此无法满足肝脏疾病建模、药物发现和器官移植领域的研究需要。

肝脏类器官的出现为解决上述问题和各类肝病研究提供了新的研究策略。

Fig.5 Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids

2018年Cell在线发表了题为《Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids》的研究论文。该研究建立了一套长期的肝细胞来源的类器官培养系统（两步胶原酶灌注法分离肝细胞、并在 Matrigel 固化后，加入 Hep-Medium（由AdDMEM/F12、15% RSPO1条件培养基（自制）、B27（不含维生素 A）等组成）、每3天更换一次培养基、7-10天传代一次）。

Fig.6 Establishment of Hep-Orgs from Human Hepatocytes

经过单细胞转录组测序分析、免疫荧光检测、透射电镜检测等结果，研究人员发现该类器官可以从单个肝细胞培养而来并可稳定生长数月，同时保持了与成体肝细胞形态、细胞结构、基因表达特征和生理功能的高度一致。单个肝细胞可形成包括祖细胞和分化肝细胞群的类器官并传代数月，模拟了肝切除后的肝脏再生过程。人胚胎和成体肝细胞在体外传代后可在缺陷小鼠的肝脏中定植和增殖。 

综上，这种3D肝细胞来源的类器官模型将为阐明肝细胞再生机制、发现肝脏祖细胞标记物、揭示肝脏疾病发生机制等重要的基础研究问题提供关键技术，也为实现肝脏自体移植和个体化医疗提供了可能。

02

中枢神经系统类器官

神经退行性疾病目前已成为老年人群的高风险疾病。而神经类器官则为研究神经系统类疾病提供了快捷、方便的模型。

国际著名期刊STEM CELL REPORTS一项题为《Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells》的文章中，研究人员使用N2B27培养基从神经上皮干细胞诱导分化了人类中脑类器官（hMOs），为研究神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症）和神经类药物开发提供了良好的体外研究模型。

Fig.7 Derivation of hMOs from Human NESCS

将四种独立的神经上皮干细胞接种于96孔板后，研究人员分别加入GSK3B抑制剂和PMA以刺激激活WNT和SHH信号通路，随后将细胞加入基质胶液滴中，2天后细胞开始分化形成hMO。

随后的10天中，研究人员观察到hMO逐渐扩大，并在20天后达到平均直径1.26 mm。同时，在27天时，研究人员观察到细胞增殖标志物Ki67的表达（早期hMOs），而在61天时，Ki67的表达显著下降（晚期hMOs）。此外，在这个过程中，研究人员还观察到神经干细胞标志物SOX2的表达比例从35%下降到18.4%。而在类器官成熟后，SOX2的表达区域也趋于固定。这些结果表明研究人员可以成功在体外建立人类中脑类器官模型。

Fig.8 Neuronal Differentiation and Self-Organization in hMOs

通过免疫荧光和流式细胞术检测，研究人员发现该中脑类器官模型形成复杂的神经元网络，并可以分化出具有中脑特点的多巴胺能神经元。

Fig.9 Differentiation into Glial Cells and Formation of Synaptic Connections

进一步地，研究人员通过免疫荧光染色证明了该中脑类器官还可以分化为脑胶质细胞，包括星形胶质细胞和少突胶质细胞。并通过突触染色和钙成像证明了中脑类器官可以发挥正常的神经元功能。

综上，这项研究建立了人类中脑特异性的类器官系统。这种类器官包含多巴胺能神经元和脑胶质细胞，这使得该神经元类器官具有成为研究神经退行性疾病的有效模型。

03

肺脏类器官

在柳叶刀发表的《1990-2017年中国及其各省死亡率、发病率和危险因素：2017年全球疾病负担系统分析》中，肺癌与肝癌一道成为我国过早死亡的前五大原因之二。因此，对于肺脏的研究同肝脏一样显得十分重要。

虽然传统体外细胞实验和动物模型已被广泛用于阐明人体肺发育、生理学和发病机制，但这些模型不能准确地再现人体肺部环境和细胞之间的相互作用。

肺类器官作为目前最接近人类肺系统的模型，为研究肺发育、功能和疾病病理学提供了强有力的工具。

在Nature cell biology上发表的一篇肺类器官研究论文中《A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells》，研究人员从人类干细胞中培养建立了肺芽类器官（LBOs），该类器官包含中胚层和肺内胚层，并能够发育分化为早期肺泡和支气管。

Fig.10 Generation of lung bud organoids.

研究人员通过维持培养基和无血清分化培养基（含B27）对人类干细胞经过25天诱导分化培养后，通过原位杂交和形态学检测发现该发育过程与小鼠胚胎中肺的发育过程一致，而其内含的多种细胞类型表现出类似于“肺芽”的结构。因此，研究人员将该类器官称为“肺芽类器官（LBO）”。

Fig.11 In vivo potential of LBOs.

研究人员进一步将该类器官移植进入免疫缺陷 NSG 小鼠肾包膜下，在1.5 个月后观察到被间充质组织包围的管状结构的生长物。通过免疫荧光检测后研究人员发现：尽管没有观察到完整的肺泡成熟表型和结构（可能由于异位位置），但该类器官包含了了异种移植后肺发育的许多基本特征，包括分支形态发生和近端规范。

进一步地，研究人员又通过呼吸道合胞病毒对肺芽类器官的功能进行了验证，结果发现肺芽类器官在感染后可以再现人类感染后相似的病理特征。并且，使用肺芽类器官还可以模拟部分的肺纤维化疾病。

综上，肺芽类器官研究不仅为肺脏类器官研究提供了参考，还为体外研究肺部感染、病理和新药开发提供了参考。

04

癌症类器官

近半个世纪以来，癌症一直是人类第一或第二大死亡原因。每年有大量关于癌症的研究论文发表。

但是，如何实现突破性的癌症研究呢？

类器官的研究使得研究人员将目光聚焦于癌症类器官，并展现了独一无二的研究前景。

在一项来自于Nature communications的研究《Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages》中，研究人员评估了人类乳腺组织类器官的分化能力，为乳腺癌研究提供新的研究平台。

Fig.12 Human mammary epithelium can be propagated without immortalization as organoid cultures.

乳腺类器官的培养为研究正常乳腺细胞行为和其致癌转化机制提供了可能。研究人员从正常人类乳腺组织中分离培养了 79 个类器官，有效率高达95%，其中最长的培养时间超过16个月。通过形态学和流式细胞检测，研究人员确定了这些类器官包含了正常乳腺基底细胞和腔细胞，并表现不同的结构类型。

Fig.13 Complex mammary-specific protein expression patterns from the tissue of origin are maintained in culture.

进一步地，质谱流式细胞技术分析证明这些类器官保持了复杂的乳腺上皮谱系，并且存在一定的差异。为了确定差异的原因，研究人员又对类器官培养基成分是否影响谱系分化比例进行了探究。

Fig.14 Distribution of mammary epithelial lineages upon removal of factors from organoid medium.

使用8种培养基组分（EGF、B27 添加剂、TGFβ抑制剂A83-01、R-spondin 1、FGF7 和 FGF10、p38 MAPK抑制剂SB202190、heregulin β1 和 Noggin）和2组对照（具有不同来源的R-spondin 1）共10种培养基对10个类器官培养物进行分析表明，在大多数情况下，从培养基中去除单个因子会影响每个乳腺谱系中细胞的比例。有趣的是，研究人员还发现而B27或EGF组分会影响类器官的整体生长和培养。

综上，研究人员建立的乳腺上皮类器官不仅保留了正常乳腺的组织的大部分功能和形态，还具有较强的异质性，为乳腺癌研究提供了良好的实验模型。

总结

从2D的iPSC疾病模型建立到3D iPSC类器官培养，科研人员正在体外一步步构建更加真实准确的生物学研究模型，为解析生命密码不断添砖加瓦。

从我们分享的各类高质量研究中，我们可以看到这些好的科研成果的取得往往离不开巧妙的实验方法和高质量的试剂。

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科学研究的进步总是站在前人成功的基础上。

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参考文献：

1.Guo, Ge, et al. "Naive pluripotent stem cells derived directly from isolated cells of the human inner cell mass." Stem cell reports 6.4 (2016): 437-446.

2.Hu, Huili, et al. "Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids." Cell 175.6 (2018): 1591-1606.

3.Monzel, et al. "Derivation of human midbrain-specific organoids from neuroepithelial stem cells." Stem cell reports 8.5 (2017): 1144-1154.

4.Rosenbluth, et al. "Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages." Nature communications 11.1 (2020): 1-14.

5.Maigeng Zhou et al. Mortality,morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet(2019).

6.Chen, Ya-Wen, et al. "A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells." Nature cell biology 19.5 (2017): 542-549.

7.Bassil, R., Shields, K., Granger, K. et al. Improved modeling of human AD with an automated culturing platform for iPSC neurons, astrocytes and microglia. Nat Commun 12, 5220 (2021).