科研丨贵州大学/西藏大学: 西藏小麦赤霉病新病原菌的生物学特性研究及其体外杀菌剂筛选(国人佳作）

编译：微科盟Missuy，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   小麦(Triticum aestivum L.)是重要的粮食作物，广泛种植于温带地区和较高海拔地区。赤霉病(FHB)是全球范围内一种具有高度破坏性的小麦病害。2020年7月，我们在西藏东南部林芝市大田观察到严重的小麦FHB症状。通过对内转录间隔区(ITS)、翻译延伸因子1-α(EF-1α)基因和RNA聚合酶Ⅱ亚基(RPB-2)基因的扩增和测序，并进行形态学鉴定，确定致病菌为Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc.。

本研究通过科赫式法则，对病原菌的致病性(在健康穗上的侵染、再次分离和鉴定)进行了确认。据我们所知，这是西藏地区首次报道F. avenaceum菌株引起小麦FHB。此外，为了探索在未来病害管理中应考虑到的病原菌生物学特征，结合西藏林芝当地环境因子及相关生态学数据，我们研究了不同碳氮源使用、温度、光照、紫外线(UV)照射对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。

结果表明，可溶性淀粉和蛋白胨分别为病原菌的最佳碳源和氮源；病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的最适温度为15-20℃，这与西藏林芝市小麦生长季的平均温度相当；8 h光照和16 h黑暗交替有利于菌丝生长，完全黑暗有利于分生孢子萌发。此外， 48 MJ/cm2的UV照射(约为当地平均紫外线强度的100倍)对分生孢子萌发没有抑制作用，说明该病原菌耐紫外辐射能力强。最后，我们还进行了有效杀菌剂的体外筛选。

在供试的7种杀菌剂中，多菌灵的抑菌效果最好，EC50值为2.1 mg/L；丙环唑对F. avenaceum也有较好的抑制作用，EC50值为2.6 mg/L。本研究提供了中国西藏新发现小麦FHB新病原菌的生物学特性见解及与当地生态环境条件的初步关联性，相关特征及有效药剂的筛选有望利于该病害未来的生态控制。  

论文ID

原名：Biological characterization and in vitro fungicide screenings of a new causal agent of wheat Fusarium head blight in Tibet, China

译名：西藏小麦赤霉病新病原菌的生物学特性研究及其体外杀菌剂筛选

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064 (中科院2区)

发表时间：2022.8.5

作者：唐小力、贡桑央金、古桑卓玛、郭小芳、曹鹏熙、易本琳、王梧嵋、德吉、Matias Pasquali、Ivan Baccelli、 Quirico Migheli

通讯作者：陈孝玉龙 & Tomislav Cernava

通讯作者单位：贵州大学/西藏大学/奥地利格拉茨工业大学

DOI号：10.3389/fmicb.2022.941734

实验设计

前言

Triticum aestivum L.是最早被驯化的谷类作物，在人类历史上，谷类作物提供了蛋白质、脂肪、矿物质、维生素和膳食能量等主要营养来源，发挥了重要作用。5000年前小麦被传入中国，并成为仅次于水稻的第二大重要作物。

如今，中国已是世界上最大的小麦生产国和消费国(CIMMYT，2014)。在西藏，小麦是除青稞(Hordeum vulgare var. coeleste L.)以外的主要种植作物之一。西藏小麦平均产量为6-7吨/公顷，远高于2.8吨/公顷的世界平均水平。西藏地处高海拔地区，CO2浓度相对较高，这会抑制叶片的光合作用对小麦品质产生不利影响。

此外，正如目前在世界范围内观察到的那样，小麦品质也会受到真菌病害的影响。例如，主要由Fusarium graminearum (anamorph Gibberella zeae)复合种(FGSC)引起的赤霉病(FHB)就是一种在全球范围内对小麦造成经济损失的病害。除FGSC外，Fusarium culmorum和Fusarium avenaceum是引起FHB的最常见病原菌，而且它们的地理分布似乎与环境条件相关。在农产品行业，FHB的流行不仅会降低谷物产量和品质，还因其产生有毒的次生真菌代谢物污染谷物。 

在过去几年中，全球范围内FHB的流行频率大幅增加。特别是在中国，长期的小麦-玉米轮作、减耕措施的推行和高敏小麦品种的种植是FHB在黄淮河流域快速扩张的主要原因。培育抗FHB小麦是国际上应对疫病感染和传播的常用策略。此外，杀菌剂也被广泛筛选并用于控制FHB。在以前的研究中，三唑类杀菌剂(麦角甾醇生物合成抑制剂)可通过抑制F. graminearum的子囊孢子萌发和菌丝生长来抵抗FHB。一些苯并咪唑类杀菌剂，如多菌灵，几十年来一直被用于控制FHB。然而，大量长期使用杀菌剂控制FHB导致不同镰刀菌种群和分离株对杀菌剂产生了抗性。除对杀菌剂产生抗性的因素外，病原菌生物学和环境因素也可能促进疾病的发展以及对杀菌剂的耐药性。因此，研究病原菌的生物学特性与环境因素之间的关系是必要的。同时，还需要对从特定环境中分离出的病原菌进行有效的杀菌剂筛选。

西藏素有“世界屋脊”、“世界第三极”的美誉，因独特而又敏感的生境，使其成为植物和微生物的独特栖息地。过去，条锈病和白粉病是西藏小麦的主要病害。然而，关于西藏小麦FHB的发生及其致病因子知之甚少。此外，了解病原菌的生物学特性，作为其疾病流行病学的基本信息，以及当地分离株对常用于控制该疾病的杀菌剂的敏感性很重要。 本研究报道了中国西藏东南部林芝市大田的小麦FHB，旨在确定该地区小麦FHB的致病因子、评估病原菌对重要环境因子的响应，并在体外筛选有效的杀菌剂，为该地区未来小麦FHB的防治提供依据。

结果

1 形态特征

从病穗中分离得到21株镰刀菌样分离株(图1A)。菌落生长早期呈白色，规则圆形，7天后逐渐变蓬松(图1B)。所有分离株的纯培养物保藏于贵州省山地农业病虫害重点实验室病原真菌库(登录号GZUPP: 1450)。在PDA平板培养基的背面观察到有明显的粉红色色素沉着。从所有分离株中筛选出1株代表性菌株Fusarium sp. Charlie 779进行显微观察：分生孢子单生，大孢子细长，直至略呈镰刀形，3~5隔膜，大小为30.2-60.8 ×3.9-5.4 μm (n=50)(图1D-G)。基于这些形态学特征，这些分离株符合镰刀菌属的描述。

图1. 小麦赤霉病的田间症状(A)。

Fusarium sp. Charlie 779在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上的菌落(B、C)。Fusarium sp. Charlie 779有隔菌丝上的大分生孢子(D)；Fusarium sp. Charlie 779 的大分生孢子(E-G)。比例尺：D-G=10 μm。 

2 分子表征

所得DNA序列与GenBank中其他DNA序列进行比对。对测序片段进行BLAST分析，发现与F. avenaceum序列匹配度最高(ITS,与MF687287.1有99.36%的同源性；EF-1α,与MK836081.1有99.60%的同源性；RPB2,与JX171663.1有98.79%的同源性)。DNA序列的代表性序列存储于GenBank(Charlie 779,登录号:ITS, MZ049674; RPB-2, MZ053464; EF-1α, MZ053465; Charlie 782,登录号:ITS, ON805846; RPB-2, ON833471; EF-1α, ON833468; Charlie 788,登录号:ITS, ON805862; RPB-2, ON833472; EF-1α, ON833469; Charlie 789,登录号:ITS, ON819345; RPB-2, ON833473; EF-1α, ON833470; Charlie 790,登录号:ITS, ON847358; RPB-2, ON868917; EF-1α, ON868916)，具体序列详见补充信息。此外，作者使用MEGA7软件，结合ITS序列与EF-1α和RPB-2基因序列，利用最大似然法构建了系统发育树(图2)。

图2.利用最大似然法对来自本研究的F. avenaceum Charlie 779、F. avenaceum Charlie 782、F. avenaceum Charlie 788、F. avenaceum Charlie 789菌株的ITS区、EF-1α和RPB-2的串联序列以及镰刀菌属的参考序列进行系统发育分析。分支旁的数字为Bootstrap值。 

3 致病性测定 

接种病原菌12天后，接种植株出现了典型的FHB症状，而对照植株无症状。致病性试验重复3次，结果相似。从病穗中重新分离纯化菌株，根据上述形态学和分子方法(ITS、EF-1α和RPB-2序列)确认为F. avenaceum。 

4 不同碳氮源的利用

所有供试碳源均能促进菌丝生长和分生孢子萌发(图3)。该病原菌在可溶性淀粉上的菌丝生长速度快于其他碳源。同时，该病原菌在以可溶性淀粉、D-甘露糖和葡萄糖为碳源时，分生孢子萌发率高于其他碳源。与其他氮源相比，该病原菌在蛋白胨上的菌丝生长速度更快，分生孢子萌发率更高。

图3. 碳源和氮源对F. avenaceum Charlie 779菌丝生长和分生孢子萌发的影响。不同碳源上的菌落生长直径(A)，不同碳源上的分生孢子萌发率(B)，不同氮源上的菌落生长直径(C)，不同氮源上的分生孢子萌发率(D)。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。数据为平均值±SD (n=3)。 

5 温度和光周期的影响

该病原菌能够在15-25℃的温度范围内生长(图4A、B)。温度高于25℃时分生孢子萌发率下降。高于30℃时，菌丝和分生孢子均不生长。8 h光照和16 h黑暗交替有利于菌丝生长，完全黑暗有利于分生孢子萌发(图4C,D)。

图4. 温度和光周期对F. avenaceum Charlie 779菌丝生长和分生孢子萌发的影响。不同温度下的菌落生长直径(A)，不同温度下的分生孢子萌发率(B)，不同光周期下的菌落生长直径(C)，不同光周期下的分生孢子萌发率(D)。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。数据为平均值±SD (n=3)。 

6 紫外线照射的影响

波长为254 nm、48 MJ/cm2的UVC照射1 min，不会抑制病原菌的分生孢子萌发(图5)。但UVC 240 MJ/cm2下照射时间超过5 min，会显著抑制分生孢子萌发。

图5. UVC照射对F. avenaceum Charlie 779的影响。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。数据为平均值±SD (n=3)。 

7 杀菌剂试验 

代表性菌株F. avenaceum Charlie 779对所选7种杀菌剂表现出不同的敏感性(表2)。在供试的7种杀菌剂中，多菌灵的抑菌率最高，EC50值(50%最大效应浓度)为2.1 mg/L。其次是丙环唑，也显示出对F. avenaceum的抑制作用，EC50值为2.6 mg/L。腈菌唑和嘧霉胺的抑菌效果中等，EC50分别为24.6 mg/L和79.2 mg/L。相比之下，福美双、代森锰锌和恶霉灵对F. avenaceum Charlie 779的抑制率较低，EC50分别为136 mg/L、261 mg/L和251 mg/L。此外，根据回归方程，丙环唑的斜率最大，为4.8；代森锰锌的斜率最小，为2.1。这表明F. avenaceum对丙环唑最敏感，对代森锰锌的的敏感性最低。 

表1 用于杀菌剂敏感性测定的物质浓度及其中国农药注册编号。

表2. 7种杀菌剂对F. avenaceum Charlie 779的抑制作用。

讨论

小麦是西藏(地处中国西南高海拔地区)重要的营养来源。本研究通过形态学和分子鉴定、以及致病性测试，确定了F. avenaceum为西藏小麦FHB的病原体。这也是西藏地区首次报道F. avenaceum菌株引起小麦FHB。 在欧洲北部和中部地区，F. avenaceum已被报道为小麦FHB的致病菌。该病原菌在间作季节可能以菌丝体、子囊壳或厚垣孢子的形式在宿主作物残体上繁殖，然后通过空气传播到小麦。此外，环境和营养因素(温度、光照、碳源、氮肥等)对小麦FHB感染有很大影响。此前有研究显示，波兰的低气温会增加FHB的病害严重程度。

在一些地区，主要致病因子就是F. avenaceum。这与作者从西藏林芝地区(6月平均气温15.0℃，7月平均气温15.2℃)分离到F. avenaceum的研究结果相一致。此外，作者还探究了温度对病原菌F. avenaceum Charlie 779菌丝生长和分生孢子萌发的影响，发现15-20℃是其最适温度范围。此前研究表明，氮肥的施用会影响小麦FHB的发病。合理施用氮肥可通过影响冠层特性和植物生理来减少小麦FHB的发生。相比之下，高氮利用率降低了抗氧化酶的活性，并可能因此增加FHB的发病率和强度。

在本研究中，(NH4)SO2作为唯一氮源，促进了F. avenaceum菌丝生长和分生孢子萌发。因此，作者建议在西藏受F. avenaceum影响的麦田中，应慎重考虑以(NH4)SO2为主要氮源的化肥施用量。的氮肥。二氧化碳(CO2)也可能影响小麦品质和FHB发病。Hay等人发现，在CO2浓度升高时，FHB抗性品种中蛋白质、淀粉、磷、镁等营养元素含量变化较大。因此，未来的小麦育种需要选育既能保持营养完整性，又能抵抗FHB的品种。此外，外加碳源可以改变真菌毒素的生物合成。特别是在F. avenaceum分离株中，蔗糖是产生恩镰孢菌素的最佳碳源之一。

在本研究中，作者发现所有供试碳源都支持菌丝生长和分生孢子萌发。但该病原菌在可溶性淀粉上的菌丝生长和分生孢子萌发均高于其他碳源。在今后的研究中，调查除CO2外的其他碳源如何影响该病的流行，并探讨如何在小麦育种中考虑它们将非常重要。同时，减少可增加FHB发病率和真菌毒素产生的碳源施用，可为该病的可持续管理提供新的解决方案。 据报道，光周期是可能影响植物病原菌生物学特性及其发病机制的重要环境因子。

在本研究中，作者发现8 h光照和16 h黑暗交替有利于F. avenaceum Charlie 779的菌丝生长，且完全黑暗条件有利于其分生孢子的萌发。这与F. fujikuroi FKMC 1995菌株不同：光照对其菌丝生长和分生孢子萌发无显著影响。同样，Zhu等人也有类似的发现，即F. oxysporum F0112的菌丝生长和分生孢子萌发不受光周期的影响。然而，对于一些F. oxysporum菌株，完全黑暗可显著诱导菌丝生长和/或分生孢子萌发。

因此，Fusarium spp.中，菌株菌丝生长和分生孢子萌发对光周期的特异性响应可能广泛存在。 对于一些病原菌如白粉病病原菌Blumeria graminis，紫外线照射可以通过限制预侵入过程来减少感染和增殖。然而，对于位于宿主组织内部的F. oxysporum等病原菌，当其一旦形成菌丝，即可保护病原体免受自然照射。在本研究中，作者发现在UVC 48 MJ/cm2(比林芝自然条件强近100倍)照射下，不能显著抑制F. avenaceum菌丝生长和分生孢子萌发。这说明高UVC照射不会影响F. avenaceum引起的FHB。

化学防治是小麦FHB防治的主要措施之一。因此，作者对可能有效的杀菌剂进行了体外筛选(图6)。7种供试杀菌剂中，多菌灵和丙环唑的抑制率最好，EC50值分别为2.1 mg/L和2.6 mg/L。与前人研究结果一致，多菌灵和丙环唑均对FHB致病菌F. graminearum有效。Doohan等人报道称，嘧霉胺对FHB症状没有减轻作用。在本研究中，嘧霉胺对F. avenaceum表现出中等程度的抑制作用。

一般情况下，福美双和代森锰锌与其他杀菌剂联合使用可抑制FHB分离株的菌丝生长。但在本研究中，这些化合物在体外单独应用时，对F. avenaceum的抑制率较低。对于腈菌唑和恶霉唑，目前还没有关于其对FHB分离株影响的报道。有趣的是，作者发现腈菌唑对F. avenaceum有较高的抑制作用。相比之下，恶霉唑效果较差。本研究证明了多菌灵、丙环唑和腈菌唑对西藏地区小麦FHB的化学防治潜力。

图6. F. avenaceum Charlie779在不添加(CK)/添加杀菌剂的PDA平板上培养7天的菌丝生长情况。

丙环唑(A1: 100μg/mL, A2: 50 μg/mL, A3: 10 μg/mL, A4: 5 μg/mL, A5: 1 μg/mL, A6: CK)、腈菌唑(B1: 100μg/mL, B2: 50 μg/mL, B3: 10 μg/mL, B4: 5 μg/mL, B5: 1 μg/mL, B6: CK)、嘧霉胺(C1: 1000μg/mL, C2: 500 μg/mL, C3: 250 μg/mL, C4: 125 μg/mL, C5: 62.5 μg/mL, C6: CK)、福美双(D1: 500μg/mL, D2: 300 μg/mL, D3: 150 μg/mL, D4: 30 μg/mL, D5: 15 μg/mL, D6: CK)、代森锰锌(E1: 300μg/mL, E2: 100 μg/mL, E3: 50 μg/mL, E4: 25 μg/mL, E5: 12.5 μg/mL, E6: CK)、多菌灵(F1: 6μg/mL, F2: 3 μg/mL, F3: 1.5 μg/mL, F4: 0.75 μg/mL, F5: 0.38 μg/mL, F6: CK)和恶霉灵(G1: 200μg/mL, G2: 100 μg/mL, G3: 50 μg/mL, G4: 25 μg/mL, G5: 12.5 μg/mL, G6: CK)。 

与其他植物病原真菌一样，F. avenaceum的一般适应性和环境因素可能有助于其产生杀菌剂抗药性。考虑到本研究的菌株来自于西藏较为独特的生态环境，其生物学特性可能与其他普通栽培地区的菌株有所不同，它们可能更容易或不容易产生抗性。因此，关于西藏林芝地区FHB的发生、防治、病原菌生物学特性及其耐药性之间的关系和/或相关性有待进一步研究。 

本研究为中国西藏小麦FHB的发生、致病机理以及病原菌的生物学特性和候选杀菌剂提供了新的见解。综上所述，我们需要结合病原菌的生物学特性与当地生态环境因子，进一步探索与研发针对西藏FHB的有效且可持续的绿色防控方法。