急性呼吸窘迫综合征预警生物标志物的研究进展及蛋白质组学应用

王宇 陈林胡利莎 姚尚龙

华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430022

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(7):737-740.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210905-00592

 基金项目 

湖北省技术创新专项（2019ACA167）

REVIEW ARTICLES

【综述】

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是一种常由严重感染、休克、输血等多种肺内外疾病引起的急性呼吸衰竭综合征，以肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿为主要病理改变，以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征。常见于高危手术患者或ICU患者，对于麻醉与危重症医师来说是一个极大的挑战。

肺损伤的概念最早是在1994年由欧美共识会议上提出[1]，促进了ALI/ARDS的临床实践和研究，以及流行病学发展。2011年最新拟定的Berlin定义根据低氧血症的程度提出了3种不同严重程度的ARDS[2]。根据Berlin定义，既往的“ALI”已经不存在，可认为ALI为轻度的ARDS。Berlin定义的提出更有利于对ARDS的预后和临床干预的疗效进行分级评价[2]，但目前仍然存在较多需进一步明确和完善之处：不同呼气末正压（positive end‑expiratory pressure, PEEP）水平通气下检测的氧合指数数值对ARDS严重程度分级是否有影响；吸入气中氧浓度分数改变时氧合指数的改变是否影响ARDS诊断的一致性；ARDS可与心衰或容量负荷重共存，难以排除心源性呼吸衰竭。ARDS目前仍然没有得到充分的认识，5例中有2例被临床医师漏诊，40%的实际病例没有被发现[3]。除了诊断困难和漏诊率高，ARDS的诊断需要满足PEEP≥5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），而往往此时患者已经气管插管或者呼吸机通气，一旦诊断后病情往往进展迅速，晚期干预措施有限。因此，提高ARDS的早期识别率有利于ARDS诊断的同时也是改善预后的关键。

目前，ARDS的Berlin定义是基于临床和生理变量的组合。缺乏ARDS的特异性生物标志物可以说是ARDS新型诊断和治疗进展的最重要障碍之一。所以在ARDS病程早期，生物标志物的意义重大，特别是生物标志物的预测和诊断价值更加客观、特异和有效。但目前临床实践上还没有生物标志物被证实可用于诊断ARDS或预测其预后[4‑5]，临床上急需特异性ARDS标志物。

1 ARDS的预警生物标志物      

生物标志物是指可供客观测评的某种特征性生化指标，通过对其的测定可以获知机体所处的生物学进程。检查一种疾病的特异性生物标志物可对疾病的诊断及预防起到关键作用，在干预和治疗阶段根据生物标志物的水平也可以为预后和治疗方案的调整提供参考，这种生物标志物也称为预警标志物。目前已有部分研究探索了生物标志物参数在ARDS的预测、预后评估中的价值[6‑18]。

1.1　不同原发病导致的ALI/ARDS预警生物标志物

危重患者气道和肺组织中性粒细胞炎症高峰可能与ARDS的发生相关，基质金属蛋白酶‑9活性的变化可以作为中性粒细胞高峰启动的标志物，对于整个危重患者亚群ARDS风险具有预测价值[6]。Samanta等[7]发现了细胞因子水平与全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）评分结合可以建立一个良好的预测急性胰腺炎患者ALI发展的模型。研究发现，患者的TNF‑α、IL‑6、IL‑10、IL‑8和IL‑1β水平联合SIRS评分对ALI进行预测具有较高的灵敏度和特异性。对于脑卒中相关的ALI，脑损伤后血谷氨酸水平与ALI的发生、严重程度和远期预后密切相关[8]。研究还发现，新发发热的危重病患者中，IL‑6和降钙素原具有一定的ARDS预测价值，但血管紧张素2是唯一能够预测发热危重病患者ARDS严重程度和预后的生物标志物[9]。急性A型主动脉夹层患者接受CPB手术，围手术期多种因素导致血小板活化，术后肺损伤发生风险高。研究发现，血浆P‑选择素水平升高的A型主动脉夹层患者术后ALI风险较大[10]。一项荟萃研究针对20种与高危人群ARDS发病相关的血浆生物标记物进行了分析，乳酸脱氢酶、晚期糖基化终产物可溶性受体、血管性血友病因子和IL‑8的组合预测危险度最高，而血浆转铁蛋白、蛋白C浓度与ARDS发生概率呈负相关[11]。在重症脓毒症/感染性休克患者中，血清IL‑8、帕金森病蛋白7水平升高与初期ALI有显著关系[12]。帕金森病蛋白7的早期升高强调了内皮损伤在ALI发病初期中的重要性。此外，血浆黏蛋白1对脓毒症患者ARDS的发生也有一定的预测价值[13]，并且入院第3天的血浆黏蛋白1对ARDS脓毒症的预测价值要高于入院当天的预测价值。由此可见预警生物标志物的预测价值是动态变化的。

1.2　ALI/ARDS预后相关的预警生物标志物

Alladina等[14]提出了“biomarker‑directed ventilator management”的治疗理念，研究发现血浆生长抑素二型受体和IL‑6可作为指导ALI/ARDS患者停止机械通气和再次插管的预警生物标志物。在急性损伤情况下，预测选择性抑制肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）1可减轻与TNF‑α相关的细胞死亡和炎症，同时保护或增强TNFR2信号的保护作用。研究者针对TNF‑α分子开发了TNFR1拮抗剂（GSK1995057），并在体外、体内和涉及健康人体的临床试验中评估了其疗效，结果发现其可显著减轻炎症和肺损伤征象[15]。感染性休克和ARDS患者尿液经过检测发现，其中内皮细胞糖萼的降解碎片指数与急性肾损伤、住院病死率相关[16]。内皮细胞糖萼是血管屏障的重要组成部分，它在调节血管壁通透性，介导剪切力对内皮细胞信号转导和抑制凝血与血细胞的黏附过程中起着重要调节作用。研究显示，内皮细胞糖萼对单肺通气时肺损伤有一定的保护作用，但其保护作用的机制尚未完全阐明[17]。近年来，研究发现，细胞外组蛋白也在ARDS发病和进展中具有重要作用[18]。机体炎症或损伤发生时，组蛋白的过度释放可能通过促进组织损伤和全身炎症而在ALI中发挥作用，并可能成为反映ARDS严重程度和预后的一种新标记物。

1.3　ALI/ARDS相关的预警生物标志物研究的局限性和思考

目前为止，仍然还没有一种特异的生物标志物能够可靠地预测ARDS的发生或预后。综合各方面因素分析原因如下：① 缺乏全面筛选ARDS发展前和早期的生物标志物研究。大部分研究是针对ARDS发病后的患者进行生物标志物测定，无法确定生物标志物的变化是ARDS的结果还是原因。在ARDS发生、发展之前确定某种生物标志物需要对大量患者进行筛选，工作量较大，未来可针对可能发生ARDS的特定高危人群进行筛选研究。② ARDS的发病机制十分复杂，炎症、内皮细胞或者上皮细胞的损伤、凝血活化和血管通透性的变化等在时间和空间上往往出现交叉重叠，而且生化指标的浓度是动态变化的。生物标志物信息的异质性和差异较大，情况复杂，限制了单一的生物标志物的研究意义和价值[19]。未来需要更全面、更多的大样本研究来进行高通量筛选，获得预警优度高的特异性ARDS生物标志物或者生物标志物组。③ ARDS可由各种肺内外疾病引起，原发病众多，比如脓毒症介导的ARDS，胰腺炎介导的ARDS，心外科CPB手术后、机械通气和输血相关的ARDS等。生物标志物可能由于原发病种类不同存在异质性，如直接肺损伤（direct acute lung injury, AD）和间接肺损伤（indirect acute lung injury, AI）的上调和下调的生物标志物就存在差异[20]。因此，进行ARDS生物标志物研究需要保证研究对象为同质人群，限制了研究结果的推广。

2 应用蛋白质组学筛选研究ARDS预警生物标志物      

2.1　蛋白质组学研究概述

蛋白质组学是指系统研究某一基因组所表达的所有蛋白质，是对由一个物种或一个细胞、组织表达的所有蛋白质的研究。蛋白质组学的分析目的在于鉴定样本中尽可能多的肽和蛋白质混合物的组分。蛋白质组学基于质谱技术的全谱分析，可为蛋白质高通量的定量和修饰分析提供参考信息。蛋白质组学的发展对寻找疾病的诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等有重要意义，也因此被广泛应用于医学研究。通过临床生物样本进行蛋白质组学的研究，在各系统和重要器官的疾病诊断及治疗策略等方面有广阔的应用前景。

2.2　ARDS生物标志物的相关蛋白质组学研究

与疾病相关的标志蛋白质主要有3类：① 疾病相关（特异性）蛋白质；② 生物标志分子；③ 信号转导分子。蛋白质组学探测预警作用相关标志蛋白质的基本策略是蛋白质组的比较，即健康与病变组织、细胞或体液等标本的蛋白质表达谱差异和表达量变化，且检测的生物标本取自疾病发展之前或者早期。

研究某一疾病发生、发展的特异性生物标志物的思路，一般分为3个部分：标志物的筛选、标志物的验证和标志物的确认[21]。从单蛋白质鉴定到蛋白质组学的发展大大加快了ARDS标志蛋白质研究的步伐。蛋白质组学可以分为非靶向蛋白质组和靶向蛋白质组筛选，生物标志物开发的过程中，非靶向蛋白质组方法可能更适合于生物标志物发现的早期阶段，而靶向蛋白质组方法更适合于验证和实施[22]。很多浓度较低的蛋白质在传统的蛋白质组学分析方法中可能会被遗漏，将质谱技术应用到蛋白质组学分析中可以在成百上千的样本中高通量筛选成千上万的蛋白质。之后再应用靶向蛋白质组学分析十几种到几十种差异表达的蛋白质，增大发现预测价值高的特异性生物标志物的可能。蛋白质组的筛选将为ARDS的生物标志物提供大量的数据，结合后续的标志物验证和确认工作，将更加全面地探索到与ARDS发生、发展、转归相关的生物标志物群，确定蛋白质分子与ARDS之间的关系，为临床干预和预警提供科学依据。

2.2.1　非靶向筛选候选生物标志物

ARDS中蛋白质组学的筛选研究才刚开始，非靶向筛选的研究结果确定了众多候选生物标志物。根据生物样本类型，可分为血标本、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）、呼出气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）以及肺组织标本蛋白质组学；根据ARDS病程（因为差异蛋白随着病程发展动态变化），可分为渗出期和恢复期的蛋白质组学；根据不同病因介导的ARDS的差异蛋白也不同，比如AD和AI的蛋白质组学。

2.2.1.1　不同生物标本的ARDS蛋白质组学

用于检测的生物样本包括活检的肺、心脏组织（病理切片、细胞），生物体液包括尿液、血液、脑脊液、唾液、粪便、阴道分泌液等，均可用于蛋白质组学研究。肺损伤领域尚有一些特殊生物样本，如EBC、BALF、鼻咽拭子等。

最早在2004年，Bowler等[23]首次开展了蛋白质组学研究，比较了16例ALI患者和12例正常志愿者的血浆和BALF蛋白质组，发现在ALI组中以下蛋白质上调：白蛋白、血清淀粉样蛋白、血红蛋白、IgG重链、补体成分3、α2或β‑血红蛋白、α2或β2‑糖蛋白1和α2‑Heremans‑Schmid糖蛋白。相反，在ALI患者血浆中，α1‑抗胰蛋白酶、触珠蛋白和运甲状腺素蛋白水平显著降低。根据BALF标本开展蛋白质组学分析，Schnapp等[24]在3例ARDS患者中筛选出了870种不同的蛋白质，其中胰岛素样生长因子结合蛋白‑3是一种新的生物标志物，介导细胞的凋亡。EBC中含有少量的蛋白质，通过气溶胶液滴的产生离开肺部。EBC中的蛋白质模式可能有助于监测急性和严重肺部疾病，特别是监测通气期间的机械应力。研究者从30例ALI/ARDS患者和10例健康志愿者中收集EBC，对EBC标本行蛋白质组学分析发现，EBC中存在细胞角蛋白，与通气应激参数（如扩张增加、肺损伤和通气时间）密切相关，表明EBC中细胞角蛋白水平与呼吸机相关的肺实质损伤有关[25]。

2.2.1.2　不同病程的ARDS蛋白质组学

ARDS发病后不同时期的BALF存在差异表达的蛋白模式。研究发现，ARDS后第1天的差异蛋白变化较大，在ARDS后第3天和第7天仍有轻微变化[26]。Dong等[27]分别对ARDS渗出期和恢复期的蛋白质标志物进行了筛选研究。研究纳入14例ARDS患者，分别在渗出期和恢复期根据BALF的巨噬细胞发现有17种蛋白质在恢复阶段更加丰富（如S100‑A8/A9、白细胞弹性蛋白酶抑制剂等），而10种蛋白质在渗出阶段显著上调（如组织蛋白酶B、热休克蛋白27等）。

2.2.1.3　不同致病原因的ARDS蛋白质组学

Chen等[20]对不同致病原因的ARDS差异蛋白进行了研究，筛选了AD组、AI组和对照组之间的血浆差异蛋白，发现AI组和AD组中共有11种差异蛋白，而AI组中特异表达的有5种蛋白质。Nguyen等[28]筛选了呼吸机肺炎介导的肺损伤相关蛋白质组，鉴定出76种差异表达的BALF蛋白质，其中60种蛋白质在呼吸机肺炎介导的ALI中含量上调；目前尚无对ARDS患者肺组织直接进行蛋白质组学的研究。Liu等[29]开展了动物模型研究对假单胞菌诱导的ALI大鼠肺组织进行了生物标志物的筛选，研究发现，18个差异表达蛋白中11个上调、7个下调。这些差异表达的蛋白质主要与细胞代谢、抗氧化、信号转导和蛋白质结合有关。早产儿肺局部损伤的发生、发展机制尚不清楚，研究者基于蛋白质组学的质谱方法发现了通气15 min后，早产儿肺部开始出现各种损伤途径介导的损伤，随着通气时间增加，肺部损伤加重；并且损伤的发生、发展具有区域特异性，非依赖性肺的蛋白质组有较大的改变[30]。芦苇毒素是一种有效的植物毒素，也是一种重要的生物武器毒素。近年有研究从多组学角度阐述了其导致肺损伤的机制，研究发现色氨酸代谢、氨基酸生物合成等途径是重要损伤途径，为芦苇毒素中毒肺损伤提供了大规模的组学数据[31]。

2.2.2　预后和治疗干预评价

在干预和治疗阶段也可应用蛋白质组学探索差异表达生物标志物，对ARDS的预后和治疗干预进行评价，为治疗方案的调整提供参考。大量的临床样本和动物模型研究工作已经投入到预后和治疗干预靶点生物标志物的发现上。

2.2.2.1　临床样本研究

临床研究中，Bhargava等[32]针对ARDS幸存者和死亡者应用蛋白质组学进行了差异蛋白的研究。应用蛋白质组学筛选患者BALF标本发现，ARDS早期幸存者中上调的蛋白质包括凝血相关蛋白、纤维蛋白溶解因子、免疫应答蛋白以及铁稳态相关蛋白。相比之下，细胞迁移和肌动蛋白组织相关蛋白是晚期幸存者的蛋白标志物，表明BALF蛋白质组的动态变化。Ong等[33]进行了流感肺炎的肺损伤早期恢复的肺蛋白质组学研究，结果显示感染后7 d小鼠出现了显著的先天免疫应答，感染后15 d时向适应性免疫应答转变。该研究阐明了流感肺炎导致ALI在恢复期间的细胞和蛋白分子转变模式。内皮糖萼的降解与肾损伤的发生有关，研究者前瞻性地建立感染性休克、创伤和ARDS患者队列，通过对入院24 h内尿液样本的质谱分析发现，感染性休克和ARDS患者尿液中的内皮细胞糖萼的降解碎片指数与急性肾损伤、住院病死率相关[16]。蛋白质组学分析证实了儿童ARDS患者血浆组蛋白与ARDS严重程度、非肺器官衰竭、病死率独立相关。该研究结果支持核小体及其组分蛋白质作为儿科ARDS的临床显著的损伤相关分子模式，并且是一个可行的潜在治疗靶点[34]。

2.2.2.2　动物模型研究

基于质谱的蛋白质组学方法检测IL‑17A和姜黄素处理的小鼠肺组织，从蛋白质组学分析结果中发现了几种趋势，IL‑17A诱导微染色体维持蛋白2等蛋白质及控制DNA复制相关（DNA replication, DR）蛋白质的表达，而姜黄素抑制了这些蛋白质的表达水平。因此，这项基于蛋白质组学的研究提示了针对DR特异性蛋白质的治疗在控制ARDS中的潜力[35]。另外一项研究鉴定了博莱霉素或转化生长因子‑β1处理的肺泡上皮细胞中姜黄素的蛋白质靶点[36]。结果显示，姜黄素逆转了独特蛋白质的表达，如DNA拓扑异构酶2‑α、驱动蛋白样蛋白。Lu等[37]探索了氢处理对高氧暴露肺损伤的保护机制，经分析确定了可能有肺保护作用的大量蛋白质和生物过程，包括还原型辅酶Ⅱ氧化酶、凝血级联反应等。Sun等[38]建立重症急性胰腺炎相关肺损伤大鼠模型，并使用中药清胰颗粒治疗，基于质谱的蛋白质组学分析发现，模型组中蛋白质发生了明显变化，有7种蛋白质（如组织蛋白酶S）上调、2种蛋白质下调，而治疗组中这9种蛋白质呈现了完全相反的结果。

如上研究，非靶向蛋白质组筛选的研究结果确定了众多候选干预靶点，但是大多数研究人员并未将靶向和非靶向技术结合起来。因此，目前大部分研究都是针对确定候选生物标志物及其预警作用，并未针对其进行进一步验证以确定特异性的预后预警生物标志物。

3 前景和展望      

预警生物标志物在ARDS的风险预测，发生、发展机制，预后评估，干预治疗评价等多方面具有十分重要的意义，而蛋白质组学的应用让预警生物标志物的探索和验证更加全面和标准。未来需要更大人群的蛋白质组学筛选，并在临床中通过靶向验证探索各种原发病和发病机制介导ARDS的特异生物标志物，以此预测ARDS风险，设计特异性药物，判断干预性治疗效果和预后。