科研丨NAT MICROBIOL (IF:30.96): 人类肠道菌群在多个家族世代间的变异和传播

编译：微科盟如风，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

虽然人类肠道菌群的组成和功能潜力随着生命周期的推移而不断进化，但亲缘关系已被确定为微生物群落多样性的关键协变量。然而，到目前为止，家庭内共享的微生物群特征大多是在父母和他们的直系后代之间进行评估。在本研究中，我们在一个跨越3至5代的家族队列(n=102)中研究了家族微生物组模式和微生物基因型的潜在传播和持久性。我们观察到微生物群落组成与亲缘关系密切相关，7个低丰度属均表现出家族分布模式。虽然亲缘关系和当前同居作为紧密关联的变量出现，但我们对微生物基因型分布和传播估计的探索性分析指出，后者是菌株传播的关键协变量。据估计，姐妹和母女对之间的潜在传播率最高，随着女儿年龄的增长而降低，同居对之间的传播率高于分居对。虽然罕见，但我们检测到跨越3代和4代的潜在传播事件，主要涉及Alistipes和Bacteroides属物种。总体而言，虽然我们的分析证实了家庭微生物群落的存在，但菌株的传播或共同获得似乎与同居密切相关。  

论文ID

原名：Variation and transmission of the human gut microbiota across multiple familial generations

译名：人类肠道菌群在多个家族世代间的变异和传播

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

发表时间：2021.12

通讯作者：Jeroen Raes

通讯作者单位：比利时鲁汶大学

DOI号：10.1038/s41564-021-01021-8

实验设计

结果与讨论

1 多代家庭队列中的微生物组变异与年龄有关

为了探索人类宿主中可跨代传播的微生物特征的持久性，我们收集了来自居住在佛兰德斯(比利时)地区的24个多代家庭的女性粪便样本的独特数据集，附属的元数据包括人体测量学、分娩方式、同居状态，全身和局部炎症标志物水平和药物使用情况(图1a，b和补充表1)。在2015年11月至2016年11月期间对102名健康个体(年龄0-98，中位数=37.5，出生于1917年至2016年)进行了抽样调查。参与者的标准化身体质量指数(SBMI)(一种年龄和性别校正后的身体质量指数，也适用于12、13岁的儿童)在7到56之间变化(中位数= 37)，大多数人处于正常范围内(n = 60；正常范围30-39)。99人(n = 99，共102人)是通过阴道分娩出生的。家庭结构从3代到5代不等(中位数 = 4)，呈现不同程度的多代同居和地域分散特征。

在我们的跨代队列(CGC)中探索对个体间微生物组变异有显著影响的宿主或环境因素，我们将鸟枪法宏基因组测序数据与流式细胞术测量的粪便微生物负荷相结合，构建了定量微生物丰度图谱。在CGC队列的限制范围内，粪便水分(n = 101，基于距离的冗余分析(dbRDA)，属水平Bray-Curtis相异度，R2 = 4.3%，Padj = 2×10−4)和年龄(R2 = 2.9%，Padj = 2×10-4)被确定为对微生物组定量变异具有非冗余解释能力的唯一元数据变量(图1c和补充表2)。这些发现与之前关于人群队列中微生物组比例变异的报告一致，粪便水分是结肠转运时间的代表，反映了通过胃肠道时营养消耗引起的生态系统发展。此外，我们还证实了粪便含水量与微生物负荷(n = 101，Spearman检验，ρ = −0.25，P = 1.2 × 10−2)以及属水平微生物组丰富度(n = 101，ρ = −0.29，P = 3.7 × 10−3)之间的负相关关系。尽管有21名参与者报告在采样前的12个月内服用了抗生素，但在目前的CGC队列中，我们没有观察到抗生素治疗(历史)对微生物组组成的显著影响(补充表2)。跟进有关儿童早期微生物生态系统改变的报告，评估了年龄区间(<4岁的幼儿，n = 10 vs 其他人(≥4岁CGC，4+ CGC)，之间的潜在关联，n = 91)和定量的属水平微生物群组成。在多变量模型中，年龄区间显示出最大的效应量(n = 101，属水平逐步dbRDA，R2 = 8.0%，Padj = 1×10−4；补充表2)，水分对微生物组变异的贡献增加了1.7%(Padj = 1.1×10−2)。因此，我们证实，与结肠生态系统完全成熟的个体相比，幼儿拥有明显不同的微生物群。

图1 家族结构和微生物组概况 a，CGC队列中的家庭结构(n=102)。颜色代表家庭ID，线型表示当前同居状态。b，参与者在佛兰德斯(比利时)的地理分布。家庭ID的颜色如图1a所示。c，与CGC(n=101)和≥4岁的CGC(4+ CGC，n=91)队列中假设协变量独立的个体效应量相比(浅蓝色，左柱)，显著协变量对微生物群落变异的累积效应量(深蓝色，右柱)(补充表2)。年龄、SBMI、分娩方式、家庭ID、同居状态、药物使用、抗生素使用、水分含量(%)和粪便钙卫蛋白(μg g-1)被设定为潜在的微生物组协变量。d，来自佛兰德斯人群横截面的背景数据集(n=1106个样本，小点)的CGC队列(n=101个样本，较大的点)的相对微生物组谱中的个体间差异(Bray-Curtis)的PCoA。沿PCoA第一轴的样本分布将幼儿(<4岁，n=10)与其他个体(n=91)和FGFP样本(n=1106)分开；Kruskal–Wallis与事后Dunn检验，**Padj< 0.01，***Padj< 0.001。Bact1：Bacteroides 1；Bact2：Bacteroides2. e，增加的ARG负荷(n ARG/Bact2 肠型样本中的微生物负荷；n = 101，Kruskal-Wallis 检验，卡方 = 26.7，P = 6.8 × 10−6；事后Dunn检验，*Padj < 0.05，**Padj < 0.01，***Padj< 0.001；补充表3)。f,与其他个体(n = 91)和FGFP样本相比，幼儿(n = 10)中Bact2肠型患病率增加(n = 91)；配对卡方检验，Padj < 0.1；补充表4。g，与4+ CGC数据集的其余部分相比，7个细菌属在特定家族的成员中显示出显著更高的丰度(n = 91，双侧Wilcoxon秩和检验，-log10(P)> 4.56；补充表5)。颜色对应于家庭ID(如图1a)，而圆的大小与该属的平均丰度成正比。封闭的圆圈表示特定家族中丰度显著增加的属；空心圆圈表示特定家族中丰度降低的属。

2 Bacteroides 2肠型在幼儿中非常普遍

最近，我们发现了一种粪便微生物群落类型，在肥胖、炎症性肠病和原发性硬化性胆管炎以及某些多发性硬化和抑郁症亚型的人群中具有很高的流行率。这种潜在的益生菌Bacteroides 2(Bact2)肠型的共同特征包括低组成丰富度、低粪便细胞计数以及拟杆菌属(Bacteroides)和粪杆菌属(Faecalibacterium)丰度比例高和低。一般来说，Bact2肠型个体表现出粪便较松和(肠道和全身)炎症标志物较高。为了区分当前CGC中的群落状态，我们在Flemish Gut Flora Project(FGFP)数据集(n = 1106人群队列)中观察到的微生物组变异背景下，进行了Dirichlet多项混合(DMM)建模。为此，为了排除由方法差异导致的群落聚类，FGFP程序后使用16S rRNA基因扩增子测序对CGC数据集进行了额外分析。得到的扩增子谱仅用于肠分型。利用概率模型对可能来自同一群落的样本进行分组，基于DMM的分层可重复地识别跨数据集的微生物组配置，而无需对检测到的层的假定离散性质作出任何说明。观察到微生物组在4种先前描述的肠型上进行分层，分别标记为Bacteroides1(Bact1)、Bact2、Prevotella和Ruminococcaceae(图1d和扩展数据图1)。Bact2样本与其非Bact2对应样本不同，显示出较低的微生物负荷(n=101，Kruskal-Wallis检验，卡方检验= 13.9，P = 3.0 × 10−3；事后Dunn检验，对于Bact2 vs Bact1/Prevotella，Padj < 0.05)，较低的属水平丰富度(n = 101，Kruskal-Wallis检验，卡方值= 20.0，P = 1.6×10−4；事后Dunn检验，对于Bact2 vs Bact1//Prevotella/Ruminococcaceae，Padj < 0.05)和更高的粪便水分含量(n=101，Kruskal-Wallis检验，卡方值=8.8，P=0.03；事后Dunn检验，对于Bact2 vs Ruminococcaceae，Padj < 0.05；扩展数据图2和补充1)。只有一名参与者得分高于血清C反应蛋白(CRP)临床阈值(>15 mg l-1)和11名参与者高于粪便钙卫蛋白1(>200 μg g-1；补充表1)，我们没有观察到在接受Bact2的参与者中全身炎症和肠道炎症的患病率较高(n=77，卡方值=1.8，P > 0.05；n = 99，卡方检验=7.1，P > 0.05)与之前关于特定的患者群体的关联。尽管肠型分层与参与者的抗菌药物摄入史没有显著相关性(n = 95，卡方值=5.0，P > 0.05)，但低微生物负荷Bact2样本中抗菌药物耐药基因成比例地富集(ARGs；n=101，Kruskal-Wallis检验，卡方值=26.7，P =6.8×10−6；事后Dunn检验，对于Bact2 vs Bact1/Prevotella/Ruminococcaceae，Padj < 0.05；图1e和补充表3)。CGC队列中的肠型分布与FGFP人群队列中观察到的比例显著不同(n=101 vs n=1106，卡方检验=25.9，P= 9.98×10-6)，当前数据集的特征是Bact2样本的流行率较高(29% vs 12%；配对卡方检验=22.3，Padj = 9.1×10-6；补充表4)。更具体地说，幼儿(<4 岁)的Bact2配置流行率明显高于FGFP(90% vs 12%；配对卡方检验= 48.7，Padj= 1.2 × 10-11)和4+ CGC(90％ vs 22％；n = 10 vs n = 91，配对卡方检验= 16.9，Padj= 1.6 × 10-4；图1f和补充表4)。

3 排除幼儿揭示了微生物群变异的家族模式

为了表征跨代家族微生物组的相似性，我们首先评估了家族内和家族间微生物类群的丰度模式以及功能变化。鉴于家族成员间不同的微生物组(图1d，f)，我们选择将4岁以下的参与者排除在这些分析之外，留下一个n=91的队列(4+ CGC)。排除幼儿使得家族标识符是唯一重要的微生物组协变量，占属水平组成变异的14.7%(n = 91，属水平逐步dbRDA分析，Padj = 5.5×10-3；补充表2和图1c)，超过了先前确定的微生物组协变量的效应大小。因此，我们得出的结论是，在具有成熟结肠微生物生态系统的女性中，家族相关的系统发育微生物群落模式可以在多代人中识别出来。值得注意的是，在评估核心微生物代谢途径模块丰度模式的个体间差异时，没有观察到与家族的显著关联(n = 91，P = 0.23)。这些结果与功能冗余的肠道微生物生态系统的概念一致：虽然分类特征在个体之间甚至随着时间的推移可能存在很大差异，但分类群编码重叠的核心功能潜力，确保了与人类宿主的稳定相互作用。值得注意的是，4+ CGC数据集中不同家族间的ARG丰度分布也没有显著差异(n = 91，P = 0.27)。接下来，我们放大了特定的微生物组特征，而不是群落水平的变异，利用基于定量微生物组分析(QMP)的宏基因组衍生的属水平丰度的可用性。我们发现，与4+ CGC队列中其他成员相比，7个属在特定家族成员中的丰度更高(n=91，双侧Wilcoxon秩和检验，-log10(P)>4.56；图1g和补充表5)。虽然这些家族相关属中的大多数可以被定性为低丰度(平均丰度<3×106个细胞/克粪便，在数据集中平均丰度最低的分类群的20%范围内)，但有2个家族富集了假单胞菌(Pseudomonas)(平均丰度=3.74×106)、机会致病菌和草酸杆菌(Oxalobacter)(平均丰度=3.74×106)，分别与降低肾结石风险有关。作为一种补充方法，我们评估了物种或功能的流行(存在/缺失)是否在4+ CGC世代(队列谱系中的家族非随机分布)中出现家族约束。在队列中，所评估的特征(物种、核心功能和ARGs)在相关个体之间的共享频率均未超过预期(n = 91，家族谱系指数(GIF)，Padj > 0.05；补充表6)。

4 家庭成员共享密切相关的细菌基因型

对家族微生物群落模式的检测并不一定反映微生物跨代的实际传播，但也可能是由于共同的遗传背景以及生活方式和饮食习惯的文化传播选择了相似的微生物组成。为了推断同一家族成员之间可能交换或共同获得微生物菌株的情况，我们使用StrainPhlAn恢复了在未鉴定的CGC粪便宏基因组中具有足够覆盖的物种的代表性基因型(由完全覆盖的标记基因串联产生的一致基因序列)。这种方法使我们能够在CGC数据集中表征超过360个物种(包括来自幼儿的样本，n = 102；图2和补充表7)。聚焦于在单个家族中检测到至少3次且核心基因组比对高于1000个碱基对(bp)的物种，我们将分析限制在代表51个物种的2,374个基因型(每个物种的中位基因型=44，范围=13-92；扩展数据图3和补充表8)，共同构成CGC宏基因组的很大一部分(中位数=77.04%，范围=7.35-91.85%；补充表1)。对于每个物种，我们计算了作为单核苷酸多态性(SNP)数量恢复的所有基因型对之间的遗传距离(补充表9)。总体而言，对于这51个物种，从家族成员(家族内(IF)恢复的基因型之间的标准化遗传距离(NGD)低于非亲缘个体间的遗传距离(家族间(BF))的遗传距离(图3a)，表明在家族内发现的相似菌株比在家族间发现的多。对每个物种进行分析，在基因分型的51个分类群中的13个中观察到类似的模式(PERMANOVA，Padj < 0.05；补充表10)。值得注意的是，IF距离的总体分布在nGD = 0(即相同菌株)处显示出一个峰值，而BF则没有，这表明人际传播和/或最近从共同来源获得微生物的频率更高。通过拟合高斯混合模型估计在这个nGD = 0峰内的基因型配对比例，我们确认相关参与者之间高相似性配对比例显著高于非家族成员(IF = 5.71% vs BF = 2.06 %；nIF = 2450 vs nBF= 63,287，配对检验，卡方值= 86.848，P < 2.2 × 10−16；图3a)。同样，与分居(LA)的家庭成员相比，同居的家庭成员具有显著更高的密切相关基因型比例(同居=14.27% vs LA=1.81%；ncohabitation = 633 vs nLA = 1817，卡方值=28.857，P = 7.79 × 10−8；图3b)。这一发现与家庭成员之间的肠道微生物传播或共同获得的可能性较高的假设相一致，因为他们的接触密切且频繁。在家族和家庭中，高度相似的基因型主要属于拟杆菌门(图3c和补充表10)。对ARG应用类似的方法，我们还计算了从CGC个体中检索到的ARG序列之间的所有成对遗传距离(n=533 ARG簇)。评估家庭内部和家庭之间以及生活在一起或分开的家庭成员之间的ARG变体之间的nGD分布，观察到的差异(PERMANOVA，P < 0.05；补充表11)对应于家庭成员(12.31%，n = 64/520)和共同生活的参与者(15.13%，n = 59 / 390)共享的更密切相关序列。

图2 本研究中描述的CGC物种的最大似然系统发育树。显示了在CGC队列中检测到并存在于PhyloPhlAn默认数据库中的所有物种；使用StrainPhlAn分析的物种以红色显示。分支按门着色(放线菌门，红色；古菌，绿色；拟杆菌门，黄色；厚壁菌门，深绿色；变形菌门，蓝色；疣微菌门，粉红色)，外圈代表按比例缩放的流行率(蓝色)、相对丰度(百分比，粉红色)和pTR(黄色)。每个物种恢复的基因型数量由条形图(绿色)表示。

5 Bacteroidales物种显示出最高的潜在传播率

虽然菌株共享可能源于细菌种的共同获得，但共享菌株频率的增加已被认为是个体间传播的迹象。在本研究中，基于观察到的nGDs分布，并选择先前建议的相似性阈值中最严格的阈值，我们认为当nGDs < 0.10时，两种基因型属于同一菌株(图3a和扩展数据图4)。这个截断值使我们能够识别CGC队列中的1958个菌株，其中213个(属于40个物种)涉及870个潜在传播事件(补充表9和补充表10)。与家庭成员相比，无血缘关系个体发生此类事件的频率显著降低(IF = 42.02% vs BF = 12.87%；nIF = 188 vs nBF = 4912个体，卡方检验= 125.87，P < 2.2 × 10-16)。在51种基因型物种中，有35种检测到潜在的家族内传播事件，它们共同代表了肠道微生物群中80%以上的优势属(定义为前20%最丰富的属)。为了定量探索这些观察结果，我们计算了物种内和物种间的潜在传播率(pTRs)，即检测到的传播/共获取事件的数量除以一个家庭中的最大可能传播(定义为家庭成员的组合：最大= nCr(n = n个成员，r=2))。在物种间，家庭之间的平均pTRs差异很大(平均=2.75%，范围0-9.85%；补充表13)，推测反映了家庭互动模式或习惯(如卫生习惯)的差异。在物种内，我们观察到拟杆菌目成员的平均pTRs最高(包括Parabacteroides distasonis = 11.11%(0-50%)、Alistipes onderdonkii = 9.58%(0-100%)、Bacteroides faecis = 8.75%(0-50%)、Bacteroides caccae = 8.61%(0-50%)和Bacteroides salyersiae = 8.33%(0-50%)；图2和补充表13)，与它们经常从母亲传给后代的报道一致。为了可视化CGC数据集中IF菌株的共享情况，我们基于队列中恢复的基因型构建了一个最大似然系统发育树，用于可能在家庭成员之间传播的35个物种中的每一个(图3d,e，扩展数据图5和补充表13)。B. caccae和P. distasonis检测到的潜在IF传播/共获得事件数量最多，分别在9个和10个家族中的15对和14对个体之间共享(图3d,e)。

图3 基因型在家庭成员之间的传播。a，恢复所有基因型对之间的nGDs。与BF距离(蓝色)相比，IF距离(红色)的总体中位数较低。b，同居个体的nGDs达到nGDs = 0的峰值。c，nGDs< 0.1的总成对比较的比例。顶部：基于亲缘关系的比较，所有分类群的BF(y轴)比例低于IF(x轴)比例。底部：基于同居的比较，同居(x轴)参与者比非同居(y轴)个体表现出更高的比例。分类群按门着色(放线菌，红色；拟杆菌门，黄色；广古菌门，绿色；厚壁菌门，蓝色；变形菌门，紫色；疣微菌门，粉红色)。虚线表示1:1的比例。d,e，显示出最高IF传播次数的物种的最大似然系统发育树(补充表13)：B. caccae(d)和P. distasonis(e)。节点按家族ID着色(颜色编码如图1a 所示)；交换菌株的家庭成员用阴影表示。直方图中的垂直线表示IF(红色)和BF(蓝色)的nGD。f，左：按关系(ss，姐妹；md，母女；gg，祖母-孙女；gggg，曾祖母-曾孙女)和同居状态(绿色= yes，黄色= no)(Wilcoxon秩和检验，n = 102，*Padj< 0.05，***Padj< 0.001；补充表15)划分的pTRs。右图：非同居个体的亲属关系pTRs(Wilcoxon秩和检验，n = 94，r = 0.24，P = 5.85 × 10−5)。g，母女之间的pTRs随着女儿年龄的增长而降低(n = 78对，β回归，R2 = 0.21，z = −3.87，P = 1.11 × 10−4)。

6 亲属关系和同居都与较高的潜在菌株传播有关

在当前数据集中，亲属关系、同居状态甚至年龄都是细菌传播频率的潜在协变量，它们都是密切相关的变量。例如，在30岁以下的参与者中，94%报告称与母亲住在一起，96.3%的n > 2家庭中至少有一对母亲-30岁以下的女儿(补充表1)。虽然菌株分布与亲属关系显著相关(菌株存在/缺失微生物组变化，n = 102，Mantel检验，R2 = 3.7%，P = 6.5 × 10-3)，但只有同居具有显著的非重叠效应大小(逐步RDA，R2 = 8.1%，Padj = 1.3 × 10−3；补充表14)。家族内pTRs最高的是姐妹(n = 13对，平均 = 5.17%(0-38.71%))和母女对(n = 78，平均= 3.99%(0-26.32%))中观察到最高的pTRs。虽然跨越多代的pTRs显著降低(n = 49，mean = 1.33%(0-10.71%)和n= 19，mean = 1.27%(0-7.9%)，分别为1代和2代分隔的对)，但在我们的队列范围内，只有两代(母亲-女儿)和三代(祖母-孙女)之间的差异显著(n= 102，Kruskal-Wallis检验，卡方= 10.99，P = 1.18 × 10- 2；事后Dunn检验，Padj = 1.36 × 10−2；补充表15)。对于姐妹和母女对，计算的同居个体之间的pTRs显著高于分开居住的个体(Wilcoxon秩和检验，姐妹，r = 0.73，Padj = 1.64 × 10−2；母女对，r = 0.47，Padj = 1.56 × 10-4；图3f和补充表15)，再次表明同居可能促进肠道细菌交换。但总体而言，非同居家庭成员对的pTRs高于非亲缘个体(Wilcoxon秩和检验，r = 0.24，P = 5.85 × 10-5；图3f和补充表15)。为了更好地了解同居对菌株共享或潜在传播事件的影响，我们重新分析了Costea等人收集的一个家庭队列，该队列由属于6个家庭(父母和后代；扩展数据图6a)的26个个体组成。采用上述方法，涵盖498个菌株的43个物种被认为符合pTRs分析的条件(补充表17)。区分同居相关个体之间(母亲/父亲-后代，n= 28对)和伴侣之间(父亲-母亲，n=6对)共享的菌株，我们发现这两个类别的pTRs均高于非亲缘、非同居个体(n = 26，Kruskal-Wallis检验，卡方=105.65，P < 2.2 × 10−16；事后Dunn检验，Padj < 0.01；扩展数据图6b和补充表18)，尽管对伴侣的影响和样本量较小。因此，虽然我们的分析将亲缘关系确定为属水平微生物群落差异的关键协变量，但CGC和Costea等人(重新)分析并不排除同居是个体微生物群特征传播或共同获取的驱动因素，这与最近关于肠道生态系统遗传力的研究结果一致。

本研究发现，包括年幼儿童在内的成对母亲和女儿之间的平均pTRs最高，可能反映了他们之间的身体亲密关系，频率随着年龄的增长而稳步下降(n = 78对，beta回归，R2 = 0.21，z =−3.87，P = 1.11 × 10−4；图3g)，这一关联再次与同居明显相关，尽管添加该参数并没有显著提高相关性(R2 = 0.24，模型比较似然比检验P=0.16)。此外，在母亲和幼儿共有的物种中，观察到Bacteroidetes的pTRs最大，特别是B. caccae(平均=57.14%)、Bacteroides stercoris(平均=33.33%)和P. distasonis(平均=28.57%；补充表16)。虽然我们的分析没有解决方向性问题，但pTRs也反映了从女儿到母亲的潜在传播，但我们的研究结果并不与母体肠道生态系统是构成幼儿微生物群成熟过程的主要演替事件贡献者的假设相矛盾。在这方面，鉴于其低定植抗性，可以预期婴儿和幼儿微生物群的不成熟性质有助于包括通过垂直和水平传播或来自环境来源的外源性微生物组特征。最后，我们观察到A. onderdonkii(2株)、Alistipes shahii和B. faecis 的4种菌株在4个家族中连续3代存在，这可能反映了跨代持续的生态位定植(扩展数据图7)。此外，在3个家族的3个非连续世代中检测到其他4个物种的菌株。B. salyersiae和P. distasonis在其中一个中间水平上仍未检测到，而在祖母水平上发现了不同的B. caccae和Eubacterium eligens菌株(扩展数据图7)。

结论

本研究对不同世代的肠道微生物群变异的探索性分析证实，幼儿的微生物组与更发达的配置存在根本差异，家族群落结构仅在生态系统成熟时出现。尽管与非亲缘个体相比，亲缘关系的影响还反映在家庭成员之间共享菌株的频率更高，但对pTRs的估计将同居确定为菌株分布的关键协变量。与这些发现相一致的是，我们观察到IF pTRs随着亲缘关系程度和年龄差异而降低，跨代的潜在传播事件很少，但可以检测到。共享菌株主要属于拟杆菌目。总体而言，虽然我们的分析没有排除由母系遗传引起的菌株跨代传播，但在同一家庭的一级亲属中最常检测到共享菌株。

原文链接： https://www.nature.com/articles/s41564-021-01021-8

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