【醉翁之艺】七氟烷麻醉下小鼠丘脑室旁核-终纹床核神经回路对意识状态的调节

最近研究发现，麻醉诱导的无意识状态是通过与中枢神经系统中调节内源性睡眠-觉醒系统的神经回路的特定相互作用引起的，然而，在全麻期间是否存在其他关键的促进觉醒的区域，以及相关神经回路是否调节意识状态仍然未知。   丘脑室旁核（Paraventricular thalamus）是丘脑中线核的重要组成部分，接收来自多个参与全身麻醉调节区域的传入神经投射，并向边缘系统发送大量输出信号。终纹床核（Bed nucleus of the stria terminalis）位于边缘前脑，主要通过投射到自主神经系统的中继核、下丘脑和中央杏仁核，调节应激、焦虑和恐惧反应。

最新研究发现，丘脑室旁核部分神经元直接投射到终纹床核可介导饥饿诱导的觉醒行为。为此，来自华中科技大学同济医学院麻醉科和基础医学院神经生物学研究团队对七氟烷麻醉下小鼠的丘脑室旁核-终纹床核神经通路进行了相关的研究，研究结果于2022年5月发表在Anesthesiology 杂志上。 1. 七氟烷能够抑制丘脑室旁核神经元活性

图1 七氟烷麻醉下丘脑室旁核c-Fos的表达变化   

与清醒状态相比，七氟烷麻醉下c-Fos表达显著下降（图1A-B），提示小鼠丘脑室旁核神经元活动受到明显抑制，表明七氟烷能够抑制丘脑室旁核神经元活性。   

2. 七氟烷麻醉诱导和苏醒阶段抑制丘脑室旁核谷氨酸能神经元活性  

图2 抑制丘脑室旁核谷氨酸神经元活性对七氟烷麻醉诱导和苏醒阶段的影响

为了探索丘脑室旁核中谷氨酸能神经元活性，研究者在丘脑室旁核注射腺病毒（图2A），3周后发现该区域出现hM4D受体表达红色荧光（图2B）。体外应用氯氮平N-氧化物（CNO）对表达hM4D的丘脑谷氨酸能神经元进行全细胞膜片检测，发现动作电位显著抑制（图2C），提示CNO能够抑制丘脑室旁核神经元活动。   研究者进一步探讨丘脑室旁核谷氨酸能神经元抑制对七氟烷诱导的意识丧失和恢复的影响，发现七氟烷麻醉诱导后，与对照组相比，hM4D-CNO组小鼠（AAV-CaMKIIa-hM4D-mCherry）意识丧失时间显著缩短，苏醒时间显著延长（图2D-E），提示七氟烷麻醉下意识丧失和恢复与谷氨酸能神经元活动的抑制相关。此外，与对照组相比，hM4D-CNO组中半数小鼠诱导和恢复所需的七氟醚浓度显著降低（图2F-G）。结果表明，丘脑室旁核谷氨酸神经元活动的抑制会加快七氟烷诱导的意识丧失和延迟意识恢复，并增加七氟烷麻醉的敏感性。 

3. 抑制丘脑室旁核谷氨酸能神经元能够加速七氟烷麻醉下皮质镇静和抑制皮质唤醒

图3 七氟烷麻醉下丘脑室旁核谷氨酸神经元的脑电改变

七氟烷麻醉诱导后，hM4D-CNO组小鼠EEG从清醒状态快速转变到麻醉状态（图3A-C），表明抑制丘脑室旁核谷氨酸能神经元加速了七氟烷诱导的镇静。在麻醉恢复期，hM4D-CNO组小鼠EEG从麻醉状态到清醒状态的转变发生延迟（图3F-H），表明抑制丘脑室旁核谷氨酸能神经元活动会延迟七氟烷麻醉的皮质唤醒。   研究者进一步分析七氟醚麻醉诱导后的脑电图示踪，显示两组的δ波存在显著差异（图3D-E）；停药后脑电图示踪显示，hM4D-CNO组小鼠δ显著增加，θ波显著降低（图3I-J）。结果说明，七氟烷麻醉时丘脑室旁核谷氨酸能神经元发生抑制，并引起脑电图改变。 

4. 激活丘脑室旁核谷氨酸能神经元能够促进七氟烷麻醉维持阶段唤醒，减浅麻醉深度

图4 激活丘脑室旁核谷氨酸神经元延迟七氟烷麻醉诱导，加速苏醒，促进觉醒 

图5 七氟烷爆发抑制条件下，激活丘脑室旁核谷氨酸能神经元激活导致皮层激活 

研究者利用光遗传学技术激活丘脑室旁核神经元活动（图4A-C）。七氟烷麻醉诱导后，持续的光刺激使丘脑室旁核翻正反射消失的时间在ChR2-on组显著增加（图4D）；在麻醉苏醒期，ChR2-on组翻正反射恢复时间明显缩短（图4E）。结果表明，激活丘脑室旁核谷氨酸能神经元延迟了七氟烷麻醉诱导，加速苏醒。   进一步研究发现，在爆发抑制状态下，激活丘脑室旁核使脑电图爆发持续时间快速增加（图5A），爆发抑制比（BSR）显著下降（图5E）。脑电图平均功率谱密度分析显示，与预刺激相比，光刺激期间的delta、alpha、beta和gamma波段增加（图5B-D）。这些结果表明，在七氟烷麻醉维持期，激活丘脑室旁核谷氨酸能神经元能够促进皮质激活，减浅麻醉深度。 

5. 丘脑室旁核-终纹床核的神经投射

图6 丘脑室旁核谷氨酸能神经元投射至终纹床核的谷氨酸能和GABA能神经元

研究者为了进一步确定丘脑室旁核和终纹床核之间的功能连接，利用Cre依赖的逆行跨单突触追踪策略，确定接收丘脑室旁核兴奋性投射至终纹床核的特定神经元类型（图6D）。既往研究发现，谷氨酸能和GABA能神经元是终纹床核的典型和优势细胞，研究者将Cre依赖病毒注射到vglut2-Cre或vgat-Cre小鼠的终纹床核（图6E）。在终纹床核中同时表达红色和绿色荧光信号的谷氨酸能或GABA能神经元被认为是起始细胞（图6F）。在vglut2-Cre和vgat-Cre小鼠丘脑室旁核中观察到dsRed标记神经元（图6G），表明丘脑室旁核神经元投射至终纹床核的谷氨酸能和GABA能神经元，免疫荧光染色也显示共定位信号（图6H-I）。 

6. 抑制丘脑室旁核-终纹床核通路能够调控七氟烷麻醉模式

图7 抑制丘脑室旁核-终纹床核通路，能够促进七氟烷麻醉诱导，延长苏醒时间

图8 抑制丘脑室旁核-终纹床核通路，对七氟烷麻醉皮层脑电图的影响 

研究者进一步验证了丘脑室旁核-终纹床核通路在七氟烷麻醉中对意识状态的调控，结果发现，在七氟烷麻醉诱导时，hM4D-CNO组诱导时间显著缩短（图7D），且hM4D-CNO组翻正反射恢复时间明显延长（图7E）。与对照组相比，使半数小鼠丧失及恢复翻正反射所需的七氟烷浓度在hM4D-CNO组中明显下降（图7F-G），说明抑制丘脑室旁核-终纹床核通路能够促进七氟烷麻醉诱导，延长苏醒时间。 

7. 激活丘脑室旁核-终纹床核通路能够调控七氟烷麻醉意识状态

图9 激活丘脑室旁核-终纹床核通路，能够延迟七氟烷麻醉诱导，加速苏醒，促进觉醒

图10 七氟烷诱导爆发抑制条件下，激活丘脑室旁核-终纹床核通路减浅麻醉深度

激活丘脑室旁核-终纹床核通路后，ChR2-on组的诱导时间明显延长（图9D），苏醒时间明显缩短（图9E），提示丘脑室旁核-终纹床核通路可能是调控七氟烷麻醉诱导和苏醒的重要通路。在七氟烷诱导的爆发抑制条件下，激活丘脑室旁核-终纹床核通路能够导致脑电爆发持续时间迅速增加（图10A），与预刺激相比，δ功率显著增加（图10C-D），爆发抑制率显著降低（图10E）。以上结果表明，在七氟烷麻醉过程中，激活丘脑室旁核-终纹床核通路能够加速苏醒，减浅麻醉深度。  

醉翁之艺 点评

研究者评估了丘脑室旁核谷氨酸能神经元以及丘脑室旁核-终纹床核通路对七氟烷麻醉下意识状态的调节作用。发现抑制丘脑室旁核谷氨酸能神经元及其通路可促进意识丧失并延长意识恢复时间，而激活则相反。此外，七氟烷麻醉诱导和恢复期的脑电活动受丘脑室旁核谷氨酸能神经元及其通路的影响。通过光遗传调控，激活丘脑室旁核谷氨酸能神经元或其通路可促进七氟烷麻醉苏醒，降低爆发抑制状态下的麻醉深度。该研究结果提示，丘脑室旁核谷氨酸能神经元通过直接投射至终纹床核，对七氟烷麻醉下意识状态改变发挥着重要的调控作用。

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