西湖大学郭天南团队详细报道低至0.1毫克微量临床样本的高通量蛋白质组学制备方法

2022年8月5日，西湖大学郭天南团队和西湖欧米在 Nature Protocols 期刊发表了题为：High-throughput proteomic sample preparation using pressure cycling technology 的论文。

该论文详细描述了基于特色的压力循环技术（pressure cycling technology，PCT）的样本制备流程，可实现低至0.1mg极微量组织及针对细胞、粪便、泪液试纸等样本的高通量前处理过程，所得到的的肽段可以兼容各种质谱蛋白质组学分析方法。

早在2015年，郭天南博士等人就已在 Nature Medicine 发表了一篇关于PCT样本制备流程方法用于蛋白质组学的文章，随后围绕PCT技术，其研究团队做了多次改进优化。
早前的优化结果显示，针对蛋白质组学流程，PCT设备能够同时一批次处理16个样本，并且可实现石蜡组织等微量样本的分析。团队展示了两种样品处理的方法，四步法需要4.5h，而两步法仅需要2.5h。
图1：基于PCT的蛋白样品制备的高效实验流程

该方法在肽段提取产率、工作效率重现性以及稳健性上都具有突出表现，因为当组织被置于PCT微管中时，所有的反应都发生在同一管中，能够最大限度地避免因转移等操作带来的蛋白损失，以上特征，对于大队列研究的高通量定量是至关重要的。因此，该方法的优势在于，能够处理极微量的石蜡组织样本，一般适用范围为0.1-2mg。对于体液样本如血液、尿液等，若固定在试纸上该方法也可适用。另外，对于传统方法难以溶解的致密组织，PCT方法也有独特优势。
在本研究中，测试的组织样本取自6个月大的 C57BL6 雄性小鼠的肾脏组织样本，以及16名患者的 32 份石蜡人体组织样本。研究结果显示，约1 mg的新鲜组织、石蜡打孔样本回收到100 µg左右的多肽，20 µm厚的石蜡切片回收到50 µg左右的多肽 （图2a） ，其肽漏切率中位数分别为25.25%、28.04%和23.44% （图2b） 。在每类样本中，使用60分钟DDA鉴定出约4000个蛋白质 （图2c） ，并且以上三类样本的生物学重复的蛋白定量结果的皮尔逊相关系数 （R） 分别为0.77、0.75和0.85 （图2d） 。
图2：小鼠肾脏组织样本的测试结果数据a：18个新鲜、15 石蜡打孔组织（各0.8-1.2mg）样本和15个石蜡切片(20µm)样本的多肽回收率；b：多肽漏切率；c：每个组织样本用500 ng肽，60分钟DDA方法鉴定到的蛋白数；d：PD软件定量的蛋白质皮尔逊相关系数(r)。 本研究将该方法应用于包括肾脏、结肠、肺、舌、胰腺、睾丸、胃和甲状腺的8种非肿瘤组织，共获得了每毫克组织中最低 25 µg（胃）、最高 142 µg（胰腺）的肽段产量。对于这 8 种组织的 32 个石蜡组织样本（肿瘤和非肿瘤配对样本对）提取的肽段采用PulseDIA PASEF方法并用DIA-NN软件分析，可鉴定得到中位数为7991的蛋白数和75069的肽段数。 

图3：基于PCT样品制备方法在人类肿瘤组织样本中的应用a：8种类型的组织(0.8-1.2mg)的4个生物重复的多肽回收率；b：从16例癌症患者中收集的32个石蜡组织样本（肿瘤和非肿瘤配对样本）的多肽和蛋白鉴定数量。这些样本来自8种不同类型的组织。

以上两组结果表明，基于PCT的蛋白质组学样本前处理方法能够从少量样本中制备具稳健性、高通量、高产率和高重复性的蛋白质组学样本。       

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