学术先声丨NOTCH4突变作为NRAS野生型黑色素瘤免疫治疗的预测生物标志物

NRAS是黑色素瘤最重要的驱动基因之一，其在黑色素瘤的突变频率约为15%-20%，相对的，NRAS野生型患者的占比约为80%-85%，据报道NRAS野生型的患者比突变型有更好的预后。免疫检查点抑制剂(ICIs)如熟知的Pembrolizumab以及Nivolumab在黑色素瘤的治疗取得了卓越的成效。但是，可获益人群只限于一部分，如何精准筛选治疗获益人群一直是困扰临床应用的难题。 

NOTCH通路是一种极其保守的信号通路，受NOTCH受配体间的细胞相互作用调控。NOTCH家族已被明确证明在各种人类肿瘤的细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤侵袭中发挥作用。近期的一项多维度的临床数据分析发现，NOTCH1-3突变是NSCLC免疫治疗的有效预测因子。其次一个泛癌种的研究也表明NOTCH4可作为免疫治疗的潜在的预测生物标志物，这都指向NOTCH信号通路与肿瘤免疫原性和抗肿瘤免疫效能相关。然而，NOTCH家族基因突变与NRAS野生型黑色素瘤免疫治疗临床获益之间的关系尚不清楚。

近日，  山西省人民医院  与  先声诊断  合作，在  Frontiers in Immunology  （IF= 8.786）发表文章[1]，利用5个公开的免疫治疗队列的265例NRAS野生型黑色素瘤患者的多纬度的测序数据，评估了评估NOTCH4突变与黑色素瘤免疫治疗疗效之间的关系。

研究人群

研究选用Allen黑色素瘤免疫治疗的队列作为探索队列 （http://www.cbioportal.org/），再用Synder, Roh, Rizvi, Liu， 4个黑色素瘤队列作为验证队列，探索了NOTCH4突变在NRAS野生型患者免疫治疗的预测效能（图1）。

图1. 研究设计和流程图

研究结果

发现队列110例黑色素瘤患者包括76例NRAS野生型患者，其中的NOTCH1-4突变频率分别为4%、11%、5%和13%。对这4个基因的生存分析发现，只有NOTCH4突变的PFS和OS更好，NOTCH1-3均未达到显著差异。此外，在TCGA泛癌种的队列中，NOTCH4突变频率为2.96%（324/10,953），其中黑色素瘤为15.61%（69/442）排名第一（图2A）。

1. 探索队列中NOTCH4-Mut 与免疫治疗获益相关

对76例NRAS野生型的黑色素瘤患者进行分析，发现NOTCH4-Mut的患者检测到较长的PFS（mPFS为8.0月 vs.2.78月，HR = 0.49, 95%置信区间:0.24-1.04;log-rank P = 0.06，图2B）。考虑年龄、性别、分期、TMB状态后，多因素Cox回归结果显示PFS显著改善（HR = 0.35, 95% CI: 0.15-0.81;P =0.01,图2C）。在OS方面，NOTCH4-Mut患者获得了更长的OS（中位OS为49.27月vs. 8.45月，HR = 0.30, 95% CI: 0.11-0.83;log-rank P = 0.01，图2D）。在调整了上述相同的混杂因素后，仍存在显著的OS获益（HR = 0.26, 95% CI: 0.09-0.77;P = 0.02，图2E）。ORR（CR + PR）在NOTCH4-Mut患者是NOTCH4-Wt的3倍（40.0% vs. 13.11%， P = 0.057，图2F）。NOTCH4-Mut患者的DCR（CR + PR + SD）比例约为NOTCH4-Wt患者的比例的三倍（70.0% vs. 23.95%， P = 0.006，图2F）。这些结果表明NOTCH4突变可能是一种NRAS野生型黑色素瘤的潜在的ICIs治疗生物标志物。

图2. 在探索队列中NOTCH4-Mut与NRAS-Wt患者免疫治疗临床结局的关系（N = 76）

2. 验证队列中验证NOTCH4-Mut患者临床获益

为了进一步研究ICIs治疗的伴有NOTCH4-Mut NRAS野生型黑色素瘤的生存获益，我们对4个已发表的临床ICI治疗队列共计189例NRAS野生型的黑色素瘤患者进行了生存分析。NOTCH4-Mut黑色素瘤的OS优于NOTCH4-Wt患者（中位OS NR vs 26.7月，HR = 0.21, 95% CI:0.07-0.66;Log rank test P = 0.003，图3A）。在按年龄、性别、分期和TMB状态调整的与发现队列相同的多因素Cox回归模型中，NOTCH4-Mut 患者OS仍然存在优势（HR= 0.25,95%置信区间:0.08-0.84;P = 0.02，图3B）。NOTCH4-Mut与对NOTCH4-Wt也进行了探讨。与野生型患者相比，NOTCH4-Mut患者的ORR比例翻了一番（68.75% vs. 30.07%，P = 0.004，图3C）。

图3. 验证队列中NOTCH4突变与NRAS-Wt黑色素瘤免疫治疗临床结局的关联（N=189）

3. NOTCH4-Mut患者有较高的TMB和TNB

结果显示，在发现队列和验证队列中，NOTCH4-Mut组均有显著更高的TMB和TNB（图4A-D）。因此,根据NOTCH4状态和TMB水平，我们将患者分为四组：NOTCH4MutTMBHigh，NOTCH4WtTMBHigh，NOTCH4MutTMBLow， NOTCH4WtTMBLow。无论是在发现队列（图4E）还是在验证队列NOTCH4MutTMBHigh患者在所有组中有最长的OS（图4F）。有趣的是，验证队列中所有NOTCH4-Mut患者都属于NOTCH4MutTMBHigh组。而高TMB与多种因素相关，包括DDR基因改变。因此，我们使用来自MSigDB的DDR基因集，探讨DDR通路突变的差异NRAS野生型黑色素瘤中的NOTCH4-Mut和NOTCH4-Wt肿瘤。发现在TCGA队列中，NOTCH4-Mut肿瘤的DDR突变数量显著增加（图4G）。在免疫治疗队列中，DDR通路基因突变数量也是NOTCH4-Mut组更多（图4H）。

图4. NOTCH4-Mut患者与TMB和TNB有关

4. NOTCH4突变预测NRAS野生型肿瘤免疫治疗疗效的潜在机制

为了进一步探索NOTCH4突变对NRAS野生型黑色素瘤免疫治疗疗效的预测价值的基本机制。首先,利用Allen队列中28例患者的RNA数据，结合CIBERSORT探索免疫细胞浸润情况。NOTCH4-Mut的患者激活CD4记忆T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助T细胞(Tfh)和中性粒细胞在NOTCH4-Mut肿瘤中更为丰富（图5A）。鉴于NOTCH4突变与免疫细胞浸润结果之间的联系和既往研究的提示，进一步研究NOTCH4突变是否与免疫相关功能基因signature相关，在25个免疫相关基因中，与野生型相比，24个基因（96%）在NOTCH4-Mut肿瘤中表达水平更高，但有一个基因（4%）EMP1表达水平下降（图5B）。此外，富集分析结果表明包括γ-干扰素响应，DNA损伤修复，上皮-间质转化（EMT）、血管生成等通路在NOTCH4-Mut和NOTCH4-Wt肿瘤中存在显著差异（图5C）。

图5. NOTCH4-Mut与抗肿瘤免疫增强有关

总结

总之，本研究表明，在ICIs治疗NRAS野生型黑色素瘤患者中，NOTCH4突变与更好的临床结局相关。因此，NOTCH4可作为NRAS野生型患者的预测性生物标志物。未来需要在前瞻性试验中验证NOTCH4的预测价值，并进一步探索其分子机制。 
END 

参考文献： [1] Li H, Zhang Q, Duan Q, Tan Y, Sun T and Qi C (2022) NOTCH4 mutation as predictive biomarker for immunotherapy benefits in NRAS wildtype melanoma.Front. Immunol. 13:894110. doi: 10.3389/fimmu.2022.894110 撰写丨Bear 编辑、排版丨SX

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