【论肿道麻】Nature Review：肝细胞肝癌的免疫治疗

肝癌，尤其是肝细胞肝癌（HCC），是癌症相关死亡的第二大原因，其发病率在全球范围内呈上升趋势。大约50%的肝癌患者会接受系统性治疗。在过去的5年里，免疫检查点抑制剂（ICI）彻底改变了肝细胞癌的治疗。2022年3月美国纽约西奈山医学院的研究人员于《Nature Review》杂志发表了一篇名为“Immunotherapies for hepatocellular carcinoma”的综述，对肝细胞癌的免疫治疗进行了系统性概述。

十多年来，系统性分子疗法一直是晚期肝癌的主要治疗方法；几种药物作为单药已被证实有明显的生存效益，例如一线药物sorafenib和lenvatinib、二线药物regorafenib、cabozantinib和ramucirumab。然而，免疫检查点抑制剂（ICI）等免疫疗法正在彻底改变癌症的治疗方法。atezolizumab-bevacizumab方案作为标准治疗的确立，标志着一个新时代的到来。在这个时代，基于ICI的联合疗法主导了HCC各个阶段的临床研究。  

在这篇综述中，首先分析了支配HCC免疫反应的分子基础，描述了参与的关键细胞及其相互作用，强调了病因学依赖机制。其次，探讨了ICI的作用机制及其与抗血管生成药物或酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合使用的协同效应，对未来的试验设计提出建议。  

1 肝细胞癌免疫微环境

1.1免疫成分概述

1.1.1免疫细胞

在HCC免疫逃逸中具有主要免疫抑制作用的关键细胞包括：组织驻留巨噬细胞（主要是Kupffer细胞）以及单核细胞源性巨噬细胞、调节性T细胞（Treg）和髓系来源抑制性细胞（MDSC）。HCC综合多组学和单细胞分析已证实，存在免疫抑制细胞群，包括Treg和单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞（TAM），可致免疫功能障碍。TAM数量过多与HCC患者预后不良有关。B细胞在肝癌免疫生物学中具有双重、相反的作用。  

HCC的免疫抑制微环境被某些细胞所平衡。这些细胞诱导抗肿瘤免疫反应和\或能够有效清除癌细胞（图1）。CD8+T细胞通常被认为是抗肿瘤免疫的主要介质。不同的CD8+T细胞状态有不同的预后意义。天然免疫效应细胞，包括肝脏常驻细胞和肝脏浸润性自然杀伤细胞（NK）在HCC免疫监视中发挥作用。  

能够诱导抗肿瘤免疫的抗原，可来源于过表达的癌胚抗原或癌/睾丸抗原（构成肿瘤相关抗原（TAA））、病毒肽或蛋白质变体（肿瘤特异性抗原，也称为新抗原）。一些TAA在HCC中异常地重新激活，如癌/睾丸抗原黑色素瘤相关抗原3（MAGEA3）、癌胚抗原α-甲胎蛋白（AFP）和蛋白多糖3（GPC3）。新抗原可来源于肿瘤驱动基因的突变或乘客突变，以及其他基因组和转录后改变，可能会导致长期暴露于免疫系统，并诱导免疫耐受和T细胞耗尽。这一现象也被描述为慢性病毒抗原暴露。肿瘤突变负荷（TMB）与新抗原的数量有关。

1.1.2细胞因子

细胞因子和其他可溶性介质的局部环境也决定了HCC免疫浸润的组成和功能。肿瘤微环境（TME）中各种细胞分泌TGFβ、IL-10、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和\或精氨酸酶，可促进免疫抑制（图1）。肿瘤源性细胞因子CXCL5和CCL15分别募集免疫抑制性中性粒细胞和单核细胞。而肝星状细胞分泌的CXCL13则募集B细胞。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）相关的HCC中，B细胞已被证明能分化为产生促肿瘤IgA的浆细胞（图2）。相反，促炎细胞因子，如IL-2、IFNγ、CXCL10和CXCL9，吸引细胞产生抗肿瘤免疫反应。因此，这些刺激的平衡决定了免疫成分和反应的质量。

1.1.3信号级联导致免疫逃避

肿瘤固有的信号级联也会影响HCC的免疫微环境。例如，CTNNB1突变和/或WNT-β-catenin信号通路的激活可下调CCL5的表达并影响树突状细胞（DC）募集，从而促进HCC模型的免疫逃逸和ICIs抵抗。β-catenin信号也下调了HCC细胞上NKG2D配体的表达，从而阻碍NK细胞介导的MHC非依赖性免疫反应。TGFβ信号通路与免疫抑制的促肿瘤效应有关。MYC过度表达发生在大约50-70%的HCC中，导致PD-L1过度表达。TP53突变发生在约40%的HCC中，但在非炎症HCC占比更高。p53功能缺失促使免疫抑制细胞募集。ARID1A突变是HCC中常见的驱动因素，在抗肿瘤免疫中具有双重作用。HCC中CDK20的激活，促进了对T细胞有抑制活性的MDSC募集。染色体6p21的局部扩增（含有编码VEGFA的基因），导致这种细胞因子的过度表达，从而形成免疫抑制性TME。最后，免疫检查点分子PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3和TIM3等在HCC细胞中的过度表达，导致T细胞衰竭。此外，慢性HBV感染导致Kupffer细胞、肝窦上皮细胞和白细胞上PD-L1的过度表达，从而进一步提高该蛋白水平，促进该病因引起的HCC免疫抑制。

图1 HCC肿瘤微环境中主要免疫细胞类型的作用概述。

1.2病因学影响

HCC通常在慢性肝脏炎症的背景下发展的。慢性病毒感染通过2个途径促进肝癌的发生：其一，通过诱导先天性炎症激活；其二，驱动异常获得性免疫反应。获得性免疫反应在NASH-HCC转变中的作用更加突出。因此，需要彻底分析不同的HCC病因在形成免疫TME中的具体作用，以确定可用于有效免疫治疗的机制。

1.2.1病毒相关肝细胞肝癌的免疫特征

慢性HBV或HCV感染是HCC的常见病因，在癌变过程中有直接和间接的免疫介导作用。目前的抗病毒药物无法消除已整合到宿主基因组中的HBV DNA。相比之下，HCV不整合到宿主基因组中，可用直接作用的抗病毒药物消除，来降低HCC的发病率。  

HBV和HCV引发的免疫反应可能是促致癌或抗癌的。血小板产生促进坏死性炎症浸润的因子，包括病毒特异性CD8+T细胞，反过来驱动HCC的发病机制，因此可用抗血小板药物来对抗（图2a）。相比之下，有效的HBV特异性T细胞反应有助于控制表达HBV表位的HCC细胞。在临床上，通过基因工程表达针对此类表位的T细胞受体（TCR）的过继性T细胞，实现肿瘤消退。尽管如此，慢性HBV感染的特点是肝脏免疫浸润的大量改变，促进了耐受性微环境，从而限制有效的抗肿瘤免疫。此外，HBV特异性T细胞易于通过TRAIL+NKG2D+NK细胞，发生BIM介导的凋亡和缺失。慢性HBV感染还驱动抑制性免疫检查点蛋白在全局和病毒特异性T细胞上的表达，进一步限制了任何能够靶向HCC细胞的T细胞（图2a）。高度抑制性PD-1hiTreg细胞在HBV相关和非病毒性HCC中选择性富集，与不良预后相关，而CD8+组织驻留记忆T细胞与HBV相关HCC患者的良好预后相关。  

丙型肝炎病毒（HCV）通过诱导衰竭和功能失调的CD8+T细胞逃逸免疫系统。这类CD8+T细胞的特征是IFNγ的产生和CD127表达水平低、缺乏增殖以及PD-1和TIM3上调（图2b）。HCV感染的细胞可以通过促进单核细胞分泌galectin 9的外泌体，进一步维持这种功能失调状态，进而上调CD8+T细胞中TIM3的表达。此外，在慢性HCV感染期间，产生IL-2的CD4+T细胞的耗竭、抑制性CD4+CD25+Treg细胞的上调、病毒特异性产生IL-10的CD8+T细胞的上调可能促使肝癌发生。病毒逃逸突变，以及HCV核心蛋白作为免疫逃避因子并干扰MHC I依赖性抗原呈递，这两者可能是参与HCV相关HCC免疫逃逸的其他因素（图2b）。  

了解病毒相关HCC的代谢限制，可能为免疫治疗干预提供新的思路。粒细胞髓系来源抑制性细胞（MDSC）在HBV感染的肝脏中积聚，并通过耗尽精氨酸来抑制HBV特异性T细胞（图2a）。此外，由于酯化酶甾醇O-酰基转移酶1（SOAT1，也称为ACAT1）的高表达，导致胆固醇平衡破坏，促进了HBV相关HCC亚群中的肿瘤细胞增殖和迁移，同时抑制HBV/HCC特异性肿瘤浸润淋巴细胞的功能。因此，使用SOAT1抑制剂可以抵消这些影响。  

1.2.2非病毒性肝细胞癌的免疫特征

在过去的几年里，关于驱动NASH和NASH-HCC转变的细胞和分子机制有了新的认识（图2c）。在脂肪变性的背景下，血小板加速了最初的炎症过程，推动NASH和NASH向HCC的转变。这一作用是通过血小板特异性糖蛋白Ib-α（GPIbα），以及血小板与Kupffer细胞和炎性单核细胞的相互作用来实现。预防性和治疗性抗血小板治疗减少了小鼠和人类中NASH和NASH相关HCC的发生。  

其他免疫机制也参与了非酒精性脂肪性肝炎（NASH）诱发HCC。例如，肝内CD8+T细胞和NKT细胞的代谢活化，产生了自身攻击性行为，导致对肝细胞MHC I非依赖细胞毒性作用，从而导致坏死性肝炎（图2c）。这种自身攻击行为影响了接受ICI治疗的NASH相关HCC患者。  

全球高达30%的肝癌由饮酒导致。酒精增加肠道通透性，从而促使免疫调节微生物群衍生的病原体相关分子模式（PAMP）向肝脏的转移，如脂多糖（LPS）；随后，这些PAMPs可能通过对常驻巨噬细胞的影响，来抑制肝脏免疫反应（图2d）。酒精性脂肪性肝炎（ASH）与促肿瘤免疫抑制性粒细胞性MDSCs的肝内积聚有关，抑制了T细胞向肝脏募集。此外，ASH的特点是肝实质中存在中性粒细胞。已知几种细胞因子参与了ASH相关HCC的发病，包括IL-1和IL-17。

图2 肝细胞癌相关免疫反应。

1.3微生物群的调节作用

慢性肝病（包括HCC）的不同阶段都存在菌群失调，即肠道微生物群组成的改变。肠道微生物菌群可以抑制免疫监视，并通过腔内初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化代谢，来促肿瘤生长；肠道共生细菌的消耗会导致初级胆汁酸的积累，从而导致肝窦道内皮细胞分泌CXCL16，从而招募抗肿瘤CXCR6+NKT细胞。此外，代谢的胆汁酸（特别是脱氧胆酸）已被证明，可诱导肝星状细胞衰老，导致多种细胞因子释放，从而促进HCC发展。肠道微生物群在调节系统免疫中的重要性已被广泛认同。临床前研究表明，抗生素可预防HCC发展。

1.4 肝癌的免疫分类

2017年报告的HCC免疫分类，分为“炎症”类HCC和“非炎症”类HCC（图3）。“炎症”类HCC约占肿瘤的30–35%，较前增加了一个肿瘤亚类，即“免疫样”亚类。这个新的亚类具有干扰素信号强烈激活、免疫激活以及CTNNB1突变的独特特征。“非炎症”类的约65%的HCC，已根据其免疫逃逸机制，确定了两个亚类：（1）“中间”类，TP53突变丰富，染色体高度不稳定，含有干扰素信号或抗原呈递相关基因的亚细胞带频繁缺失；（2） “排除”类，以CTNNB1突变和免疫荒漠化为特征（图3）。

图3 与肝细胞癌不同免疫类别和亚类相关的细胞和分子特征。  

2免疫疗法的作用机制

2.1免疫检查点抑制剂

免疫检查点分子是抗肿瘤T细胞反应的关键调节剂，不仅可以由T细胞表达，还可由抗原呈递细胞（例如树突状细胞（DC）和巨噬细胞）和肿瘤细胞等表达。PD-1、CTLA4、LAG3和TIM3是主要的抑制性免疫检查点受体，可天然抑制T细胞活性，并在维持自身耐受性中发挥重要作用；而CD28、GITR和OX40等则是共刺激免疫检查点蛋白，可增强T细胞的扩增。PD-1和CTLA4的治疗靶点构成了实体瘤免疫疗法的主干。机制上讲，PD-L1和PD-1之间的相互作用导致T细胞激活激酶的泛去磷酸化，导致T细胞失活；因此，PD-1–PD-L1阻断可恢复效应CD8+T细胞功能。CTLA4在T细胞-抗原呈递细胞免疫突触上起抑制作用，通过促进B7共轭配体与CD28的非对抗性相互作用，导致原始CD4+和CD8+T细胞的激活增加，并重新平衡TME内的效应和调节区块。抗CTLA4治疗可激活并增加肝癌患者CD4+和CD8+T细胞的丰度，降低外周T细胞克隆性。阻断其他共同抑制性检查点，如LAG3或TIM3，以及其他刺激免疫系统的策略，是现在广泛的临床研究的重点。

2.2疫苗和细胞疗法

对HCC细胞表达的肿瘤相关抗原（TAA）（如AFP、GCP3和MUC1）可测量的T细胞反应的证明，指导了抗原特异性治疗性疫苗和细胞疗法的发展。树突状细胞（DC）用肿瘤相关抗原（TAA）表达载体转染。这种DC过继转移，已被用于优化对自然免疫反应已耗尽或功能障碍的癌胚抗原的免疫原性（包括AFP）。这些方法的临床疗效，受到HCC高度免疫抑制的TME限制，同时对调节性细胞浸润的药物抑制也是不成功的。在HCC患者中使用基因工程T细胞的经验仅限于I期研究。初步证据表明，在HLA-A*02选择性AFP高表达的HCC患者中，经TCR工程且对AFP亲和力增加的自体T细胞（AFPc332 T细胞），具有抗肿瘤活性。虽然存在细胞因子释放综合征的高风险，但是以CD133或GPC3为靶点的嵌合抗原受体T细胞，在HCC患者中，也显示出初步的抗肿瘤活性。

2.3与抗血管生成药或酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的协同作用

在晚期HCC患者中进行的一些试验显示，抗PD-1/PD-L1抗体+抗血管生成TKI或抗体，具有潜在治疗优势。  

TKI-ICI联合治疗HCC的有效性，与抑制VEGF信号相关（图4）。虽然不能排除两种治疗方式存在叠加效应，但是临床试验和小鼠模型的证据支持其为协同效应。这种协同作用可能反映了一种抑制VEGF通路调节肿瘤血管系统的能力，和/或VEGF信号对免疫细胞的直接作用。HCC中的肿瘤血管系统异常，在抑制VEGF信号后，可观察到两种主要效应（1）血管修剪，导致缺氧（2）血管正常化，从而改善药物输送，并可能增强免疫细胞附着和外渗（从而实现更有效的肿瘤免疫监测）。除了在血管形成中的作用外，VEGF是一种强大的免疫调节分子，影响TAM、MDSC、Treg细胞和效应T细胞。因此，在许多肿瘤类型中（包括HCC），VEGF信号的抑制剂可以与ICI协同作用（图4）。在这种情况下，抗PD-1/PD-L1抗体可能会增加效应CD8+T细胞、DC和NK细胞的募集和/或激活，并促进抗肿瘤M1巨噬细胞表型。同时，抗VEGF疗法可能会减少MDSC和Treg细胞的浸润和活性，并进一步降低M2巨噬细胞极化。因此，单细胞RNA测序分析已确定，VEGF是一个关键的“枢纽”，可以将TME重新编程为免疫抑制环境。最后，因为阻断VEGF通路可以消除肝窦窗，影响正常生理状态下的肝内皮细胞功能；所以，抑制VEGF信号通路，可能会影响肝脏代谢、肝脏分区的质量，甚至影响肝-肠轴的质量。  

用于治疗HCC的多激酶抑制剂的作用并不限于VEGF信号。TKI也可阻断肿瘤内源性通路。该内源性通路促使免疫细胞排斥，如MAPK、WNT-β- catenin、CDK4/6和/或PI3K-PTEN信号通路。另外，抗VEGF–ICI联合消融或经动脉化疗栓塞术（TACE），可能有利于培养抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，并通过增强肿瘤细胞坏死产生的免疫反应，激活NK细胞介导的MHC非依赖性抗肿瘤反应。

图4 抗血管生成药和ICI协同治疗机制。  

3肝细胞癌免疫治疗的前景

HCC治疗是根据巴塞罗那临床肝癌分期系统定义的。极早期和早期HCC患者应考虑肿瘤切除，或消融，或行肝移植；中期患者应接受肝动脉化疗栓塞术（TACE）；而肝功能正常且状态良好（ECOG评分）≤2）的晚期患者应接受系统治疗（图5）。最终治疗方案应由多学科团队（MDT）共同制定。  

2020年，atezolizumab+bevacizumab联合疗法成为治疗晚期HCC的标准一线系统治疗。单药pembrolizumab、nivolumab+ipilimumab是目前批准的一线TKI治疗进展患者的二线方案。

图5 免疫治疗在HCC治疗中的自然历史、当前治疗和未来展望。  

总结

肝细胞癌（HCC）是一个全球性健康问题，其发病率和死亡率不断增加。尽管手术和局部区域治疗在全球范围内得到了广泛应用，但估计约50–60%的HCC患者最终将接受系统治疗。HCC免疫微环境的构成是免疫抑制细胞、免疫效应细胞、细胞因子环境和肿瘤细胞内在信号通路相互作用的结果。其不同的病因影响免疫反应，并导致独特的微环境特征。免疫检查点抑制剂（ICI）开创了晚期HCC治疗的新纪元。抗血管生成药物和ICI联合用药可改变肿瘤内皮，从而改善药物输送，增加效应免疫细胞的渗透。与sorafenib相比，ICI类atezolizumab和抗血管生成药bevacizumab的联合治疗方案是第一个被证明能提高晚期HCC患者总体生存率的治疗方案。目前有近30项免疫疗法（单独或联合）的III期试验正在进行中。这些免疫疗法针了对所有阶段的肝癌，可能会重塑治疗格局。  

编译：陈实玉，翁梅琳  

  审核：张军，缪长虹 

参考文献：   Josep ML, Florian C, Mathias H, Mala KM, Vincenzo M, David JP. Immunotherapies for hepatocellular carcinoma.    Nat Rev Clin Oncol   . 2022 Mar;19(3):151-172. doi:10.1038/s41571-021-00573-2.  

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