抗体酵母展示系统

抗体展示技术使成功分离具有治疗潜力的抗原特异性抗体成为可能。其中，噬菌体展示系统是最成熟的系统，目前已有十几种通过噬菌体展示技术获得的治疗性抗体获批上市。近年来，其他几项技术也达到了一定的成熟程度，其中比较引人注目的是酵母展示系统。与其他展示系统相比，酵母展示系统作为真核展示系统的主要优势是其高效的翻译后修饰机制和更好的适应于合成具有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质。酵母展示系统促成了PD-1阻断抗体分子Sintilimab的产生，该分子已在中国获得上市批准，用于治疗难治性经典霍奇金淋巴瘤等适应症。
酵母展示系统技术是由Boder和Wittrup于1997年首创的。外源蛋白通过与酵母细胞壁蛋白的融合，在酵母表面展示。酵母含有200nM厚的细胞壁，由β-多糖、甘露糖蛋白和壳多糖组成。酵母细胞壁的内表面，通过形成紧密的壳多糖连接的β-1，3-葡聚糖微纤维的骨架层来阻止大分子的渗透。外表面由更易溶的分支β-1，6-葡聚糖和甘露糖蛋白组成。在大多数酵母展示系统中，展示在外细胞壁上的大多数异源蛋白通过 GPI（糖基磷脂酰肌醇）在其 C 端共价连接到 β-1,6-葡聚糖上。GPI锚定蛋白通过内质网-高尔基体分泌途径转运到酵母细胞表面，并与细胞壁甘露糖蛋白层形成β-1，6-葡聚糖桥。
虽然不同的酵母菌株被用来展示各种蛋白质和多肽，但基于酿酒酵母Aga1-Aga2的酵母展示系统是最受欢迎的系统，它具有109库容量。这种方法的原理是基于融合到Aga2蛋白上的外源蛋白的表达。Aga2蛋白本身通过两个二硫键与Aga1蛋白锚定在细胞膜上，从而在酵母表面形成一个共价复合体。外源蛋白和多肽可以与Aga2的N-端或C-端融合。利用该系统，仅在一个酵母细胞的表面就可以展示超过3×104个异源蛋白质分子。EBY100作为一株酿酒酵母工程菌株，可应用于Aga1-Aga2酵母展示系统（图1)。
图1. 酵母表面展示示意图

构建酵母展示抗体库的基础是将异源免疫球蛋白基因库克隆到酵母展示载体中，并将克隆的基因与Aga2p蛋白融合表达。酵母展示系统中使用的大多数抗体形式是单链抗体；然而，其他抗体形式包括Fabs、nanobody和完整的IgG1也可以在酵母表面展示。在酵母展示载体中插入抗体编码基因会产生107到109的文库。 通常，抗体片段与Aga2p蛋白的C末端结合，但nanobody结构除外。Nanobody从其C-末端融合到Aga2p的N-末端。这种融合导致完全暴露的CDR用于抗原结合(图2)。正交酰基载体蛋白(ACP)标签用于荧光团(或生物素)的共价连接，它允许监测酵母表面表达的nanobody的展示水平。
图2. 用于nanobody筛选的改进型酵母表面展示示意图 

在从酵母展示系统中分离抗体的过程中，使用了磁性激活细胞分选(MACS)和流式细胞仪(FACS)(图3)。为了消除流式细胞仪检测速率的限制，增加流式细胞仪的选择性，非结合性单抗片段被MACS清除。用MACS系统选择的酵母细胞用c-Myc Tag标记可用于检测ScFv或Fab的表达。
图3. 用MACS 和FACS从酵母展示的抗体文库中分离高亲和力抗体

酵母展示系统在抗体工程中的主要应用之一是亲和力成熟。与噬菌体展示系统类似，可以利用不同的随机化策略来实现，例如CDR靶向突变；酵母展示系统也可用于抗体人源化。此外，与噬菌体展示系统一样，酵母展示系统已被证明可用于设计下一代抗体，如pH依赖性抗体。 与噬菌体和细菌的展示系统相比，酵母展示系统具有多重优势。酵母作为一种单细胞有机体，依赖于真核表达机制，可以翻译后修饰来表达和折叠复杂的真核蛋白。在酵母表面锚定蛋白的C端或N端插入异源蛋白不会破坏表面蛋白的结构，也不会影响表面展示的效率。在酵母展示中，整个抗体的溶解性得到了改善。
此外，伴侣蛋白的存在有助于酵母ER中蛋白质的准确折叠。酵母细胞在FACS中的分选亲和性为其生物物理特性和大分子组合表面展示文库的高通量筛选提供了良好的基础。此外，用FACS对单个变异体进行定量和生物物理表征是可行的，而不需要亚克隆、可溶性表达和纯化。然而，酵母展示系统也有一些局限性。第一个限制是其较小的库容量，比基于噬菌体和细菌的展示系统获得的库容量低几个数量级。另外，在酵母展示系统中，由于酵母表面存在多个蛋白质拷贝，可能会发生与寡聚蛋白靶标不希望的多价结合。
图4. 酵母、噬菌体和细菌展示系统的比较

总结
抗体展示技术开启了抗体生成的新纪元，使人们能够从组合库中发现高亲和力和高活性的抗体。在过去的几十年里，噬菌体展示技术成为一种领先的展示方法，产生了十几种已被批准上市的抗体。噬菌体展示技术的成功刺激了其他展示方法的使用。酵母作为真核宿主生物用于展示比基于噬菌体展示系统可能更有优势，因为它可能包括翻译后修饰。在酵母展示中，定量的高通量FACS筛选和高效的折叠缓解了亲和力问题和小文库的多样性。毫无疑问，酵母展示技术在治疗、研究和诊断领域中将继续改进，并在未来几十年发挥显著作用。

参考文献

1.An overview on display systems (phage, bacterial, and yeast display) for production of anticancer antibodies; advantages and disadvantages.

2.Antibody display technologies: selecting the cream of the crop.

3.Applications of yeast surface display for protein engineering in yeast surface display.

4.Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.