草酸钙晶体诱导肾损伤机制的蛋白质组学与代谢组学综合策略

Gao S, Chao Y, Li N, Li H, Zhao H, Liu X, Chen W, Dong X. An Integrated Proteomics and Metabolomics Strategy for the Mechanism of Calcium Oxalate Crystal-Induced Kidney Injury. Front Med (Lausanne). 2022 Mar 3;9:805356. doi: 10.3389/fmed.2022.805356. PMID: 35308536; PMCID: PMC8927618.

草酸钙晶体诱导肾损伤机制的蛋白质组学与代谢组学综合策略

肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是慢性肾脏病（CKD）进展为终末期肾功能衰竭的重要过程。肾结石是最常见的肾脏疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，可增加肾纤维化的风险。草酸盐晶体诱导的肾损伤是肾结石的早期阶段;探索肾结石的防治机制具有重要意义。本研究采用草酸钙（CaOx）晶体诱导肾损伤的啮齿动物模型，采用蛋白质组学和代谢组学相结合的网络分析方法，揭示晶体肾损伤的机制，为肾结石的干预提供潜在靶点。采用基于UHPLC-Q/TOF-MS平台的代谢组学方法和iTRAQ定量蛋白质组学方法，从肾组织中筛选出与对照组相比，Crystal组有显著变化的肾组织中共244种代谢物和886种蛋白质。然后，应用独创性途径分析（IPA）通过关联和整合差异代谢物和蛋白质来构建蛋白质到代谢的调节网络。结果表明，CaOx晶体可通过Akt、ERK1/2和P38 MAPK通路诱导炎症反应和氧化应激，影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化，导致肾损伤，为肾结石的早期防治提供了重要方向。

关键词： 蛋白质组学， 代谢组学， 草酸钙晶体， 肾损伤， 机制

介绍

肾结石是泌尿外科最常见的疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，增加慢性肾脏病（CKD）、肾纤维化、冠心病和中风（ 1-3 ）的风险。肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是CKD进展为终末期肾功能衰竭的重要过程（ 4 ）。肾结石和肾纤维化往往会持续多年，因此在肾功能严重受损甚至发生衰竭之前，很难识别疾病进展。而且，在现阶段，无论肾结石还是肾纤维化，其发病机制尚未明确。因此，迫切需要加强对肾结石和肾纤维化机制的研究。 近年来，随着高通量技术的飞速发展，蛋白质组学和代谢组学已被广泛用于研究肾脏疾病（ 的机制，如CKD，急性肾损伤和糖尿病肾病。蛋白质组学主要关注蛋白质，而代谢组学则侧重于下游小分子代谢物。蛋白质和代谢物是连接基因型和表型的重要中间分子。蛋白质组学和代谢组学的联合网络分析是探索基因表型潜在机制的有效工具（8 ）。Wettersten等人使用蛋白质组学和代谢组学技术广泛分析了人肾细胞癌组织，发现谷胱甘肽通路在肾细胞癌细胞中上调，β氧化途径受到抑制，这为开发肾癌的新型抗代谢治疗策略提供了坚实的理论基础（9 ）。

肾结石因其患病率高、复发率高而影响患者的生活质量，加重了人们的经济负担。目前，肾结石病的研究主要集中在结石形成的机理（ 10 ， 11 ），早期诊断技术（ 12 ， 13 ），治疗策略（ 14 ， 15 ）等。肾结石的发病机制复杂，至今尚无统一结论。本研究聚焦于蛋白质组学和代谢组学的综合分析策略，而不是单一蛋白质组学（ 16 ）或代谢组学（ 17 ），分析肾结石小鼠在多个方面的内部变化，从而克服单组学的局限性，旨在进一步揭示肾结石小鼠代谢调节网络的变化。

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材料和方法

化学品和试剂

乙醛酸（50%在水中）是从TCI（日本东京）购买的。iTRAQ套件是从AB SCIEX（美国加利福尼亚州福斯特城113号）购买的。甲醇和乙腈是从默克（德国达姆施塔特）购买的。使用Milli-Q水净化系统制备超纯水（Millipore Corp.，Billerica，MA，USA）。甲酸，甲酸铵和2-氯-L-苯丙氨酸是从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得的。

动物实验和样本采集

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物护理和使用指南》进行。从上海SLAC实验动物有限公司（中国上海）购买了约40只野生型雄性C57BL / 6小鼠（7-8周）。在有条件的住房1周后，将这些小鼠随机分为对照组和水晶组，每组20只小鼠。所有小鼠都可以免费获得食物和水。Crystal组小鼠以120mg / kg的剂量注射乙醛酸盐，每日一次，持续5天，对照组小鼠以相同体积的盐水注射。在动物实验结束时，从所有小鼠的眼球中抽取血液，然后在原位有氧灌注后收获所有肾脏。将每组3个肾组织固定在4%多聚甲醛中，进行进一步的组织学分析;其他的立即储存在-80°C。在4°C下保持相同2小时后，将血液以3，500rpm离心15分钟，然后在-80°C下收集血清。

组织学和生物化学分析

处理固定组织以进行石蜡包埋，制备3-4μm切片并用Von Kossa染色。使用显微镜观察皮质和延髓交界处的肾钙沉积。使用迈瑞生化分析仪BS-380（中国广东）测定血清肌酐和尿素氮含量。采用比色法测定钙测定试剂盒测定新鲜肾组织中的钙含量，采用南京建城（中国江苏）商业试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Sod）和丙二醛（MDA）的活性。使用从南京建城（中国江苏）购买的ELISA试剂盒测定白细胞介素-6（Il-6），白细胞介素-10（Il-10），白细胞介素-1β（Il-1β），肿瘤坏死因子-α（Tnf-α），细胞间细胞粘附分子（Icam）和血管细胞粘附分子（Vcam）的水平。靶蛋白的免疫组织化学染色使用碧欧泰生物科技（中国江苏）的DAB检测试剂盒在肾脏切片上进行。所有一抗均来自Proteintech Group（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。

代谢组学分析

每组8个肾组织用于代谢组学分析。称取冷冻组织，然后用含有4μg/ ml 2-氯-L-苯丙氨酸的1.5ml 80%甲醇溶液匀浆2 min。然后，将匀浆物在4°C下以13，000rpm离心15分钟。将上清液转移到注射瓶中，并与10-μl等分试样上清液混合作为质量控制（QC）样品。 在安捷伦 1290 Infinity LC 系统上进行代谢组学分析，该系统配备安捷伦 6538 精确质量四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦）（UHPLC-Q/TOF-MS），使用沃特世 XBridge BEH 酰胺柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，马萨诸塞州米尔福德）和沃特世 XBridge BEH C18 色谱柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，米尔福德， MA， USA）。酰胺柱的流动相由含有0.1%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液（A相）和含有0.1%甲酸的乙腈溶液（B相）组成。洗脱条件为0~1 min，95%B;1–3 分钟， 95–85%B;3–13 分钟， 85–60%B;并且发布时间为5分钟以平衡系统。将流速设置为0.4ml / min;柱温设定为25°C;注射体积为4μl。C18色谱柱的流动相为0.1%甲酸（相A）和用0.1%甲酸（相B）修饰的乙腈。洗脱条件为0~2 min，2%B;2–10 分钟， 2–66%B;10–17 分钟， 66–98%B;17–19 分钟， 98%B;而且发布时间是5分钟。将流速设置为0.4ml / min;柱温设定为25°C;注射体积为2μl。质量数据是在ESI和ESI中获取的 + − 质量范围从 50 到 1，100 Da 的模式。毛细管电压在正模式下为4 kV，在负模式下为3.5 kV，气体温度为350°C，分段电压为120 V。MS/MS的碰撞能量范围为10至40 eV。 采用上述UHPLC-Q/TOF-MS方法对组织样品进行分析，并将QC样品均匀地插入序列中，以评估系统的稳定性。

大量数据的预处理基于我们之前报告的方法（ 18 ）。开源R软件包XCMS用于峰提取，对齐和集成。然后，使用SIMCA-P软件（版本11.0，Umetrics，Umea，瑞典）对这些变量进行分析，以进行多变量统计分析，以评估UHPLC-Q / TOF-MS系统的稳定性。代谢注释基于将从代谢组学分析和合并QC样品上的MS / MS谱图中获得的准确m / z值与Metlin数据库中条目的准确m / z值相匹配（ https://metlin.scripps.edu/ ）。根据MS / MS频谱图鉴定的代谢物被准确注释，并且仅基于m / z值（MS）鉴定的代谢物被推定注释。在代谢注释之后，使用安捷伦 MassHunter Profinder B.06.00 检查并量化了所有已识别的峰。在一种以上的液相色谱-质谱（LC-MS）方法中报告了一些代谢物，其中选择了QC样品的良好峰形和最小的方差系数。

iTRAQ 定量蛋白质组学分析

    基于我们之前的方案，将来自每组不同小鼠的9个冷冻肾组织用于iTRAQ定量蛋白质组学分析（19）。随机地，每组中的三个组织作为新样本合并在一起。从合并的样品中提取蛋白质，纯化，然后使用BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。使用iTRAQ缓冲液试剂盒中的还原试剂和半胱氨酸封闭试剂还原来自每个混合样品的约100μg蛋白质并烷基化，并使用测序级胰蛋白酶[1：50（w：w）]水解成肽。对照组的样本标记有113，115，117个标签，Crystal组的样本标记为114，116，118个标签。将标记的肽混合在一起，然后使用安捷伦ZORBAX 300Extend-C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）通过高pH反相液相色谱法（pH = 10）进行分馏。洗脱液被合并成10个馏分，在Eksigent nano LC-Ultra上进行分析。 断续器系统串联 TripleTOF 5600（AB SCIEX， CA， USA）。使用溶剂A（2%ACN与0.1%甲酸）以3μl /min的速率将约3μl样品加载到纳米LC捕集柱（ChromXP C18CL，3μm，3μm×0.5mm）中，以3μl/min的速率加载到纳米LC捕集柱（ChromXP C18CL，3μm，75μm×150mm）中使用溶剂A（2%ACN和0.1%甲酸溶液）和溶剂B（ACN溶液与2%水和0.1%甲酸），速率为300 nl / min，90分钟梯度洗脱为0-0.1分钟，5-10%B;0.1–60 分钟， 10–28%B;60–75 分钟， 28–50%B;75–75.5 分钟， 50–80%B;75.5–80 分钟， 80%B;80–80.5 分钟， 80–5%B;和80.5-90分钟，5%B。质量数据是在ESI模式下收集的，MS范围为350-1，250 Da，MS/ MS范围为100-1，500 Da。每个周期最多选择40个前体进行碎片化，使用滚动碰撞能量，动态排除18 s，碎片的电荷设置为+2至+5。++

质谱由MASCOT蒸馏器软件（版本2.6）提取，并去除同位素。然后，在基于Mascot的Uniprot下载的蛋白质数据库中搜索所有MS / MS光谱（Matrix Science，伦敦，英国;版本2.6.0）。Scaffold（版本Scaffold_4.8.2，Proteome Software，Inc.，波特兰，俄勒冈州，美国）用于鉴定肽和蛋白质。支架局部FDR为<1%的肽被认为是可信的，具有两种独特肽的蛋白质被认为是可信的。Scaffold Q+（版本Scaffold_4.8.2，Proteome Software，Inc.，波特兰，俄勒冈州，美国）用于肽和蛋白质的定量。使用Mann-Whitney检验和Benjamini-Hochberg调整来分析两组之间的差异。

代谢物和蛋白质的综合独创性通路分析

      使用独创性途径分析（IPA）软件分析定量的差异蛋白和代谢物（Qiagen，Redwood City，CA，USA）。将包含差异表达蛋白和代谢物的ID、折叠变化值和p值的数据集上传到IPA进行核心分析，其中可以进行与草酸钙（CaOx）晶体诱导的肾损伤相关的规范途径、疾病和功能、上游调节剂分析、毒性分析和网络分析。规范通路显示整个数据集中最重要的相关规范通路（代谢通路和信号通路）。疾病和功能分析检查数据集中已知影响疾病和功能的分子，将分子的变化方向与文献中得出的期望进行比较，然后根据变化方向对每种疾病和功能进行预测。IPA上游调节剂分析用于识别上游调节剂，并根据在数据集中观察到的分子变化，根据上游调节剂和目标之间的预期因果效应预测它们是否被激活或抑制。毒素清单是已知参与特定类型毒性的分子清单。IPA-Tox分析将毒性函数与毒性列表结合使用，将实验数据与临床病理学终点联系起来，了解药理学反应，并支持毒性假说产生的作用机制和机制。网络分析模块分析具有共同功能的分子之间的相互作用，以构建网络。整个核心分析依赖于Ingenuity®知识库，该知识库由IPA内容科学家根据文献手工策划。IPA评分主要基于p和z评分的值，p的值基于右尾费雪精确检验算法计算，反映实验中一组有意义的分子与已知过程/途径/转录之间的关联是否来自随机匹配。而 z 得分算法旨在降低随机数据生成重要预测的机会。如果分子/功能的z评分大于2，则通常认为其被显着激活，如果小于−2，则认为其被显着抑制。

结果

组织学和生化分析

Von Kossa染色在皮质和延髓交界处的肾组织显示晶体组（ 图1A、B ），晶体组肾钙含量显著高于对照组（ 图 1C ).同时，在乙醛酸盐注射后测量血清肌酐和血尿素氮水平升高（ 图 1D，E ).基于免疫组织化学染色，在草酸盐晶体诱导的肾损伤后，可检测到不同蛋白质的表达显着较高，包括Serpina3，Anxa3，Cd44，半乳糖凝集素-1（Lgals1），Krt8，Lcn2，Cd14和S100a4（补充图1）。

图 1

Von Kossa染色切片（×400）（n = 3）的肾钙和生化分析（n = 5）在对照组和晶体组中。（A）用对照组的Von Kossa染色的肾片，（B）用晶体组的Von Kossa染色的肾切片，（C）对照组和晶体组的肾钙含量，以及（D，E）对照组和晶体组的血清肌酐和血氮水平。数据表示为sd±平均值，与对照组相比*p<0.05，与对照组相比，**p<0.01。

代谢分析

使用上述UHPLC-Q / TOF-MS方法获得的组织样品和QC样品的代表性总离子色谱图（TIC）如图2所示。使用 XCMS 软件包提取了大约 2，219 个（酰胺 pos）、690 个（酰胺否定）、1，559 个（C18 pos）和 416 个（C18 否定）特征。归一化后，将特征导入SIMCA-P进行多元统计分析，然后采用无监督主成分分析（PCA）观察QC样品的聚集情况以及对照组与晶体组的分离趋势。如 PCA 评分图 （ 图2 ），QC样本收集良好，Crystal组与对照组明显分离。这些结果表明，该系统是稳定的，Crystal组的代谢谱与对照组的代谢谱显着不同。按照上述方法进行数据预处理后，鉴定并定量了368种代谢物。与对照组相比，晶体组有244种代谢物，变化超过1.3倍，FDR调整后的p值<0.05，上调代谢物119种，下调125代谢物。不同的代谢物和蛋白质显示在补充材料中。

图2 基于代谢物的对照组、晶体组和 QC 样品的主成分分析 （PCA） 评分图。（A） 使用酰胺列的 ESI 模式下的绘图，（B） ESI 中的绘图 + − 模式使用酰胺柱，（C） 使用 C18 列的 ESI 模式下的绘图，以及 （D） ESI 中的绘图 + − 模式使用 C18 列。

蛋白质组学分析

在这个iTRAQ实验中，我们总共鉴定了187，510个光谱和5，191个蛋白质。共有886种蛋白质，晶体组和对照组之间有显著变化（折叠变化>1.3，调整p<0.05）。其中，与对照组相比，上调697种蛋白质，下调189种蛋白质。不同的蛋白质和代谢物显示在 补充材料 中。

代谢物和蛋白质的综合 IPA

采用独创性通路分析整合886种差异蛋白和244种差异代谢物进行核心分析。 图 3A 显示前 20 个显著失调的规范通路 （|z 得分 > 2|）。整合素连接的激酶（ILK）信号传导，Rho家族GTP酶的信号传导，整合素信号传导，急性相应答信号传导，使用rho调节基于肌动蛋白的运动性，肌动蛋白细胞骨架信号传导，IL-8信号传导，RhoA信号传导，嘌呤核苷酸降解II（需氧），内在凝血酶原激活途径，肝纤维化信号传导途径，巨噬细胞中一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的产生，染色体复制的细胞周期控制， 瓜氨酸生物合成被显著激活，缬氨酸降解、异亮氨酸降解、亮氨酸降解、脂肪酸β氧化（FAO）、RhoGDI信号传导和氧化磷酸化均受到显著抑制。

图 3 基于差异表达的蛋白质和代谢物的可信规范途径和疾病或功能注释（| z  得分>2|和  p  < 0.05）。 （A）  规范途径。 （二） 疾病或功能说明。 橙色表示激活（ z  得分 >2）;蓝色表示抑制（ z  评分< −2），较深的颜色表示更显著的激活或抑制。

与对照组相比，选择Crystal组表达量相差2倍或0.5倍的蛋白质和代谢物，用于疾病和功能分析，毒性分析，上游分析和网络分析。根据疾病和功能分析，Crystal组的以下过程显着增加：细胞的活化，白细胞的结合，白细胞的活化，吞噬细胞的活化，抗原呈递细胞的活化，单核白细胞的活化，T淋巴细胞的归位，外渗，趋化性和白细胞的归巢，其被归类为细胞间信号传导和相互作用，免疫细胞运输， 和炎症反应（ 图 3B ).

上游调节剂分析可以预测上游调节剂，这些调节剂可以调节所提交分子的变化。Il6，Tnf，Osm，Il10，Il1B，Csf2，Nos2，Cebpa和Agt被确定为上游细胞因子，酶，转录调节剂或生长因子。数据集中的目标分子显示在 表 1 .

表 1蛋白质和代谢物的上游调节剂，其显示晶体组和对照组之间的2倍以上（z评分>2）。

一个偏置项是数据集偏倚和上游稳压器偏倚的乘积。当该项的绝对值为0.25或更高时，则上游监管机构的预测被认为是有偏差的（20）。此类行在“注释”列中标有“偏差”一词。

b定义重叠的p值以测量数据集中网络调控基因的富集，而不考虑调控方向。该计算基于单侧费舍尔精确测试，该测试假设具有恒定数量基因的随机数据集作为零模型（20）。

毒性分析显示，Anxa3、Cd14、Cd44、Lcn2、Umod、Dpysl3、甲型肝炎病毒细胞受体1（Havcr1）、Hp、Serpina3和Lgals1是急性肾功能衰竭（AKI）、持续性肾缺血再灌注损伤、急性期反应蛋白阳性以及线粒体和线粒体膜跨膜电位增加（ 表 2 ).

表 2

蛋白质和代谢物的毒性分析，显示Crystal组和对照组之间的差异超过2倍。

独创性毒性列表

一个-日志（p 值）

b率

分子

在单独的窗口中打开

一个–log（p 值）反映了差异表达的分子与毒性过程之间的关联是否来自随机匹配。

b该比率显示了差异表达分子与毒性列表中总分子的重叠程度。

对显着差异表达的蛋白质和代谢物的网络分析如补充表1所示（评分>20）。可信网络与免疫性疾病、炎症性疾病、炎症反应、脂质代谢、分子转运、小分子生化、氨基酸代谢和胃肠道疾病有关。得分最高的2个网络与免疫性疾病、炎症性疾病和炎症反应相关，并合并在一起。合并的最高分网络显示，Arg1，Basp1，Cd14，Havcr1，Hp，Lcn2，L-plastin（Lcp1），Marcks，Pacs1，Tpm1，Umod，Akr1b10，Aldh1a2，Cdkn2aipnl，Coronin 1A（Coro1a），Krt20，Krt8，Loxl2，Rbm3，S100a4，乙酰L-肉碱，柠檬酸，L-半胱氨酸，高citrulline，瓜氨酸，吲哚烷（indoxyl sulfate），kynurenic，磷酸胆碱，1，4-IP2和N-乙醇酰神经氨酸在我们的数据集中显着上调。这些分子通过Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK和促炎细胞因子相互作用，分子活性预测因子（MAP）预测连接子被激活（ 图4 ).

图4

与免疫性疾病，炎症性疾病和炎症反应相关的顶级网络基于Crystal组和对照组之间显着差异表达的蛋白质和代谢物。红色形状表示上调分子，绿色形状表示下调分子。预测图例在图例框中进行批注。

炎症和氧化应激相关分子的验证

根据通路分析、上游调节剂和网络分析，测定了肾组织中的炎症细胞因子、粘附分子和氧化应激指数，以表征炎症和氧化应激状态。肾组织中 Il-6、Il-10、Il-1β、Tnf-α、Icam、Vcam、GSH-Px、Sod 和 MDA 的水平或活性显示在 图5 .

图5

白细胞介素-6（Il-6），白细胞介素-10（Il-10），白细胞介素-1β（Il-1β），肿瘤坏死因子-α（Tnf-α），细胞间粘附分子（Icam），血管细胞粘附分子（Vcam），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（Sod）和丙二醛（MDA）在对照组和晶体组的肾组织中的水平或活性（n = 5）。*p与对照组相比<0.05，与对照组相比，**p<0.01。

与对照组相比，晶体组的促炎因子Il-6，Il-1和Tnf-α的水平以及粘附分子Icam和Vcam的水平增加;抗炎因子Il10水平降低，表明CaOx晶体可诱导炎症反应。晶体组MDA水平升高，GSH-Px和Sod活性降低，表明CaOx晶体诱导氧化应激损伤。不幸的是，两组之间Il-10，Tnf-α，GSH-Px和MDA的差异并不显着，这可能是由于样本量小。

讨论

为明确肾结石疾病的发病机制，本研究进行了蛋白质组学与肾组织代谢组学的联合分析，相互验证和互补，从而更系统、全面地分析了生物分子的功能和调控机制，为肾结石疾病的防治提供了理论支持。大多数肾结石部分或完全由CaOx组成（ 21 ），因此，在我们的研究中进行了由乙醛酸盐诱导的CaOx晶体肾损伤小鼠模型（ 。 与对照组小鼠相比，Crystal组小鼠的蛋白质和代谢物发生了显着变化。 IPA软件的规范通路分析表明，多种炎症相关通路（ILK信号传导，整合素信号传导，肌动蛋白细胞骨架信号传导，Rho家族GTP酶和RhoA信号传导以及IL-8信号传导），氧化应激（巨噬细胞中NO和ROS的产生，急性期反应信号传导）被显着激活;支链脂肪酸降解与FAO均显著下调。 根据疾病和功能的分析，与对照组相比，Crystal组的细胞间信号传导和相互作用，免疫细胞运输和炎症反应增加。 根据网络分析，Cd14，Havcr1，Hp，Lcn2，Umod，Lcp1，Coro1a，Krt8，Loxl2和S100a4通过激活Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK和促炎细胞因子相互影响，并且与免疫性疾病，炎症性疾病和炎症反应有关。 在这些网络节点中，Cd14、Lcn2、Umod、Havcr1 和 Hp 是 AKI、持续性肾缺血再灌注损伤和急性期反应蛋白阳性的原因。

Cd14是一种促炎蛋白，作为Toll样受体的共受体参与先天免疫系统（ 23 ）。一项队列研究表明，肾功能不全患者的促炎 Cd14 水平升高。这可能是由于炎症状态增加，导致肾功能不全的发展（ 24 ）。Cd44是一种普遍表达的跨膜糖蛋白，并且还调节促炎信号传导作为具有Toll样受体4和MD-2的独特受体复合物（ 25 ， 26 ）。Havcr1，也称为T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1（TIM-1）或肾损伤分子（KIM-1），是TIM基因家族的成员，其广泛参与免疫细胞活性的调节（ 27 ， 28 ）。随着各种形式的损伤，KIM-1表达在近端小管上皮中显着上调（ 29-32 ）。KIM-1含有免疫球蛋白结构域和O-糖基化粘蛋白亚结构域（ 29 ）。该结构表明KIM-1是一种上皮细胞粘附分子，它可能参与缺血后肾近端小管上皮细胞的表面粘附相互作用（ 30 ）。中性粒细胞明胶酶相关的脂质释放酶（Ngal，Lcn2）是脂质红素家族的一种小蛋白，通常被认为是急性肾损伤的生物标志物 。肾脏的全基因组分析显示，Lcn2是来自Randall斑块区域的组织中的最高上调基因，这被认为是肾结石形成的焦点（ 35 ）。Ngal在嗜中性粒细胞和上皮细胞中表达，与炎症和急性肾损伤有关（ 36 ）。肾脏中的Ngal可能来自肾小管细胞和嗜中性粒细胞浸润肾脏（ 36 ， 37 ）。Uromodulin，也称为Tamm-Horsfall蛋白，由Umo在肾上皮细胞中独家表达，并且与估计的肾小球滤过率（eGFR）相关（ 38 ， 39 ）。一些Ummod风险变异可能增加尿球蛋白表达，然后诱导盐敏感的高血压和肾脏损伤（ 40 ）。S100a4蛋白，几个S100超级家族，可以通过与免疫细胞上的特异性受体结合来放大炎症反应，以促进先天免疫的激活，细胞分化，细胞死亡，或炎症介质的分泌作为警报蛋白（ 41 ， 42 ）。Anxa3是其中一种膜联蛋白，其Ca2+依赖性磷脂结合蛋白（ 43 ）主要与磷脂酰乙醇胺相互作用。据报道，Anxa3的失调与癌症的发展和进展有关（ 44 ）。Serpina3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（ 45 ）。此外，Serpina3在肾脏中的作用可能是平衡肾脏损伤后的炎症，氧化应激和肾纤维化（ 46 ）。角蛋白是上皮细胞骨架的中间细丝，并以器官和上皮细胞特异性方式表达（ 47 ）。Krt8是一种II型角蛋白，在肾单位的所有上皮细胞中表达（ 48 ）。Krt8表达在肾小管损伤的不同模型中显着增加，并被认为是上皮细胞应激损伤的标志物（ 49 ， 50 ）。Lgals1，一种碳水化合物结合蛋白，在RCC癌组织中显着增加，并且与癌细胞增殖，侵袭有关（ 51 ， 52 ）。据报道，Lgals1可以触发涉及线粒体膜电位增加的凋亡程序，并通过杀死抗肿瘤效应T细胞在肿瘤免疫逃逸中起关键作用（ 53 ）。最近的一项研究表明，Lgals1在大鼠模型和CKD群体中的肾小球中持续高度表达，并与eGFR呈显着负相关，这表明Lgals1可能在肾小球的损伤过程中起关键作用 。 值得注意的是，几种色氨酸代谢物，硫酸吲哚啉，犬尿酸和黄腐酸在Crystal组中显示出接近或超过10倍的增加。大多数色氨酸被犬尿氨酸代谢途径代谢，而犬尿酸和黄腐酸是犬尿氨酸代谢途径的代谢物。色氨酸也被细菌色氨酸酶代谢以产生前体吲哚，然后其中一些主要在肝脏中被CYP2E1和磺基转移酶转化为硫酸吲哚 。硫酸吲哚碱是一种尿毒症毒素，在受损的肾脏中显示出显着增加（56 ）。最近，许多报道已经提出，色氨酸的肠道代谢物激活芳烃受体（AHR）信号通路（57 ，58 ），其可诱导氧化应激和炎症 并介导肾纤维化（60 ）。Hippuric acid，一种肠道来源的尿毒症毒素（61 ），在Crystal组中也显着增加（5.881倍）。膳食多酚通过使用结肠细菌通过多种酚类反应途径转化为苯甲酸，然后通过甘氨酸-N-酰基转移酶（GLYAT）与甘氨酸结合，在肝脏或肾脏中产生马尿酸（62 ）。一项研究表明，积累的马尿酸可以通过诱导氧化应激来促进肾纤维化（63 ）.晶体群中积聚了多种尿毒症毒素，表明CaOx引起肾小球滤过率下降，尿毒症毒素会进一步加速肾功能不全的进展。

炎症相关信号通路的变化

    作为组织损伤和炎症的重要标志物，粘附分子在炎症反应中起重要作用。与对照组的小鼠相比，与细胞粘附相关的途径（例如，ILK信号传导，整合素信号传导，肌动蛋白细胞骨架信号传导以及Rho家族GTP酶和RhoA信号传导）在Crystal组的小鼠中显着上调。ILK是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在NF-κB活化中起着至关重要的作用。NF-κB是炎症的重要调节因子，在调节炎症反应中起着关键作用。ILK可以通过细胞外基质（ECM）与整合素或炎症刺激（例如脂多糖（LPS）和Tnf-α]之间的相互作用通过PI3K途径激活。活化的ILK磷酸化NF-κB的p65亚基，触发NF-κB核易位和下游基因（炎性细胞因子，趋化因子，粘附分子等）的表达。整合素是一系列跨膜细胞表面分子，它们构成了ECM的主要粘附受体，对于多细胞生物体的存在是不可或缺的。整合素聚集在基质粘附位点内的能力调节信号转导途径，不仅调节细胞粘附和运动，还调节基因表达。整合素可以与粘附分子（例如，Icam和Vcam）相互作用，以诱导细胞质尾部的必要构象变化以触发促炎信号传导。在我们的研究中，蛋白质组学结果和生化分析都表明，与对照组相比，Crystal组中的Icam和Vcam显着上调。肌动蛋白细胞骨架是真核细胞的基本结构成分，其对非生物和生物刺激有反应。肌动蛋白细胞骨架也是炎症中细胞功能的核心，例如整合素介导的细胞粘附部分取决于肌动蛋白细胞骨架的重组（66，67）。最近的研究表明，平衡的肌动蛋白丝周转可以保护上皮屏障并减轻体内粘膜炎症期间的组织损伤（68）。在我们的研究中，如 图4 ，两种肌动蛋白捆绑蛋白LCP1和Coro1a与肌动蛋白直接相关，并在Crystal组中显着上调。Lcp1主要在白细胞中表达，调节白细胞粘附和信号转导（67）。Coro1a属于进化保守的肌动蛋白结合蛋白家族。在炎症过程中，Coro1a是β2整合素的新型调节剂，通过诱导粘附，粘附加强，扩散和迁移来调节多形核中性粒细胞（PMN）的运输。RhoA被认为是Rho家族的小GTP酶，参与许多细胞过程，包括细胞结构，ROS形成，细胞粘附和迁移，细胞凋亡，肌动蛋白细胞骨架运动和细胞分化（70）。Rho激酶（ROCK）具有ROCK1和ROCK2亚型，RhoA / ROCK信号通路已被证明与免疫系统激活水平和促炎因子的产生有关，这些因子具有许多类型的下游靶标，包括NF-κB，肌球蛋白轻链（MLC），MLC磷酸酶（MLCP）和肌球蛋白磷酸酶靶向亚基-1（MYPT-1）。作为ROCK的重要下游靶标，NF-κB活化程度与炎症严重程度之间存在很强的关系。

氧化应激相关途径的变化

     一氧化氮和ROS主要由线粒体电子传递链，NADPH氧化酶和过氧化物酶产生（72）。在正常的生理条件下，NO和ROS的产生和清除之间存在平衡。然而，当机体产生过量的ROS，其超过抗氧化防御系统的清除能力时，过量的ROS可能通过破坏或修饰蛋白质，核酸，脂质和其他生物大分子来影响细胞存活，导致组织损伤。ROS生成诱导DNA氧化损伤，导致肾小管和内皮细胞死亡，伴有促炎因子的激活。此外，炎症可能进一步放大氧化应激。炎症和氧化应激之间的相互关联的过程最终导致肾损伤（72）。规范通路分析显示，巨噬细胞中NO和ROS的产生显著增加，相关蛋白Akt1、Apod、Apoe、Clu、Cybb、Fnbp1、Lyz、Mapk3、Ncf2、Nfkb2、Rela、Rhob、Rhoc、Rhog和Sirpa在晶体组中上调，Cat（蛋白质组学数据）在模型组中下调。此外，如 图5 ，GSH-Px和Sod在晶体组中下调，MDA上调。MDA是脂质过氧化的最终产物，增加的MDA表明机体处于脂质过氧化状态。Sod、GSH-Px和Cat是常见的抗氧化物质，它们在Crystal组中均有所下降，表明机体的ROS清除能力下降。

FAO途径的变化

    对IPA的规范通路分析表明， FAO 在Crystal组中受到显著下调。与对照组相比，晶体组下调了中链特异性酰辅酶A脱氢酶（Acadm）、长链脂肪酸-辅酶A连接酶1（Acsl1）、甲基谷氨酰辅酶A水合酶（Auh）、过氧化物异构体双官能酶（Ehhadh）、羟酰辅酶A脱氢酶（Hadh）、异戊酰辅酶A脱氢酶（Ivd）和非特异性脂质转移蛋白（Scp2）。这些蛋白质在Crystal组中下调。这些酶是参与粮农组织线粒体的重要酶，特别是Acadm，其缺乏症是粮农组织最常见的疾病，也是最常见的先天性代谢错误之一 。

细胞能量代谢中最有效的ATP产生系统是线粒体FAO，它可以产生106-129个ATP，具体取决于FA链中的碳数量。肾脏是一个高度代谢的器官，使用高水平的ATP来维持电解质和酸碱稳态并重吸收营养物质。能量消耗是各种肾脏发育和进展的关键因素。一些文献研究还表明，近端小管中的粮农组织是ATP生成的主要来源（ 75 ）。粮农组织是肾脏中ATP的首选来源，其功能障碍导致ATP耗竭和脂质毒性，以诱发肾小管损伤和炎症以及随后的纤维化进展（ 76 ）。Kang等人发现，肾小管上皮细胞中有缺陷的脂肪酸氧化在肾纤维化发展中具有关键作用 。

在FAO的过程中，长链脂肪酸首先被激活为酰基辅酶A，使其通过细胞质基质中的酰基辅酶A合成酶渗透到线粒体外膜（OMM）。肉碱棕榈酰转移酶-1（Cpt-1）位于OMM上，催化酰辅酶A转化为酰基肉碱的酯交换反应。酰基肉碱通过肉碱-酰基肉碱转座酶穿梭于线粒体内膜（IMM）。酰基肉碱通过IMM蛋白Cpt-2重新转化为酰基辅酶A。因此，Cpt-1或Cpt-2对于脂肪酸的正常氧化至关重要;几项研究显示，下调或不足的Cpt-1或Cpt-2对缺血性、顺铂AKI和糖尿病肾病等多种肾脏疾病受损的粮农组织至关重要（ 78-80 ）。从代谢组学数据中发现，Crystal组的总长链酰基肉碱比对照组增加，这表明Cpt-2将酰基肉碱重新转化为酰基辅酶A的过程中存在紊乱。酰基辅酶A的β氧化涉及脱氢，水合，再氢化和硫解。作为β氧化循环第一步和第三步的重要限速酶，Acadm和Hadh在Crystal组中被还原。此外，Acsls还可以将游离的长链脂肪酸转化为酰基辅酶A，并在脂肪酸代谢中起关键作用（ 81 ）。在我们的研究中，Acsl1在Crystal组中被下调。另一方面，脂肪酸代谢物苯乙酰甘氨酸作为线粒体受损FAO的重要标志物（ 82 ），在Crystal组中上调（34.454倍）。综上所述，粮农组织在水晶组小鼠中受到了明显的干扰。

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结论

  在我们的研究中，结合蛋白质组学和代谢组学策略与IPA生物信息学分析，我们筛选了代谢分析，蛋白质分析在CaOx晶体诱导的肾损伤小鼠中发生了显着变化，发现CaOx晶体可以通过Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK途径诱导炎症反应和氧化应激，并影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化， 导致肾损伤。