科研 | Science子刊(IF:30.63): 缺乏X-连锁凋亡抑制蛋白促进肠道炎症微生物触发器的敏感性

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

炎症性肠病（IBD）的特点是对遗传易感宿主中的微生物群产生不适当的免疫反应，但对将个体遗传改变与微生物群依赖性炎症联系起来的途径知之甚少。在此，我们证明了与孟德尔IBD相关的X连锁凋亡蛋白抑制剂(XIAP)的缺失，使Paneth细胞对微生物群、肿瘤坏死因子（TNF）、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和RIPK3依赖性细胞死亡敏感。这与Paneth细胞衍生抗菌肽的缺乏以及微生物群分层和组成的改变有关。XIAP的缺失不足以引起肠道炎症，但对能够促进肉芽肿性回肠炎的病原菌具有易感性，这可以通过施用Paneth细胞衍生的抗菌肽来预防。这些数据揭示了宿主微生物相互作用的关键途径，这是肠道内环境稳定和炎症预防所必需的，并且易于治疗靶向。

论文ID

原名：Deficiency in X-linked inhibitor of apoptosis protein promotes susceptibility to microbial triggers of intestinal inflammation

译名：缺乏X-连锁凋亡抑制蛋白促进肠道炎症微生物触发器的敏感性

期刊：Science Immunology

IF：30.63

发表时间：2021.11

通讯作者：Sebastian Zeissig

通讯作者单位：德累斯顿工业大学

DOI号：10.1126/sciimmunol.abf7473

实验设计

结果

1 Xiap缺乏与Paneth细胞改变有关

为了研究XIAP缺失促进肠道炎症的机制，我们检查了Xiap缺陷小鼠（Xiap-/-雌性和Xiap-/y 雄性，以下称为XiapKO小鼠）并将结果与野生型(WT)同窝小鼠进行比较。Xiap+/+雌性和Xiap+/y 雄性，以下称为WT小鼠）。与先前的研究一致，在无特定病原体（SPF）条件下维持的XiapKO小鼠在小肠（图S1A）或大肠（图S1B）中未表现出自发性肠道炎症的组织学证据，并且在小肠（图S1C）和大肠粘膜（图S1D）中显示出未改变的细胞因子表达。

XIAP是NOD1/2信号传导的关键调节因子，混合129S1/Sv/C57BL/6背景下的Nod2缺陷与选定的Paneth细胞衍生防御素的表达减少有关，后者是一个抗菌肽家族。鉴于这些观察结果和XIAP在肠上皮中的大量表达（图S1、E和F）以及在线数据库（proteinatlas.org/search/XIAP），我们研究了XiapKO小鼠回肠。出乎意料的是，定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示，与野生型同窝小鼠相比，XiapKO小鼠回肠中Paneth细胞衍生基因的表达存在广泛缺陷，其中包括α-防御素和其他杀菌效应物（如溶菌酶（Lyz1））的表达降低（图1A）。

值得注意的是，Paneth细胞衍生基因表达的这些广泛改变与Nod2−/−小鼠不同，Nod2-/-小鼠在129S1/Sv/C57BL/6混合背景上显示出单个Paneth细胞衍生防御素表达的选择性降低，并且没有改变α-防御素或溶菌酶在C57BL/6背景上的表达，这是本研究中使用的XiapKO小鼠的遗传背景。尽管Nod1中已经描述了所选粘蛋白和抗菌肽的表达降低−/−C57BL/6背景的小鼠，这些小鼠在Paneth细胞衍生基因的表达方面也没有表现出普遍的缺陷。

总之，这些结果表明，XIAP缺乏与Paneth细胞特征的广泛改变，不同于在没有NOD1和NOD2的情况下观察到的改变。尽管在57BL/6背景下的Nod1-/-小鼠中描述了所选粘蛋白和抗菌肽的表达降低，但这些小鼠也没有表现出Paneth细胞衍生基因表达的一般缺陷。总之，这些结果表明XIAP缺乏与Paneth细胞特征的广泛改变有关，这与在没有NOD1和NOD2的情况下观察到的不同。

与野生型同窝小鼠相比，XiapKO小鼠回肠中的Paneth细胞数量减少，与Paneth细胞衍生基因的表达受损一致（图1B）。在XiapRING小鼠中进行了类似的观察，这些小鼠缺乏对XIAP 的E3连接酶活性至关重要的C端RING结构域（图1B）。同样，这些结果同样，这些结果不同于在Paneth细胞中没有显示数值变化的Nod2-/-小鼠。IBD风险位点与Paneth细胞的表型变化有关，其特征是含有抗菌肽的分泌颗粒分布的改变，这与生物失调和对依赖微生物群的肠道病理学的易感性相关。

因此，我们检测了含有溶菌酶的分泌颗粒在Xiap缺陷小鼠回肠中的分布。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠和XiapRING小鼠均表现出表型改变的Paneth细胞中含有减少或紊乱颗粒的比例增加（图1C）。电子显微镜（EM）证实了Paneth细胞的丢失、分泌颗粒的异常定位以及Paneth细胞形态的额外超微结构变化，包括线粒体结构的丢失（图1D）。由于XIAP在抑制细胞死亡中起着关键作用，我们研究了XIAP缺乏是否与Paneth细胞死亡增加有关。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的Paneth细胞对切割的caspase-3呈阳性的比例较高，这与缺乏XIAP时Paneth细胞死亡增加一致（图1E）。这些缺陷是Paneth细胞特有的，因为其他分泌性IEC如杯状细胞和肠内分泌细胞的相对丰度没有改变（图1F和G以及图S2A）。

与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠杯状细胞（Muc2）、肠内分泌细胞（Chga）和吸收性肠细胞（Alp1）相关基因的RNA表达没有变化（图1H）。此外，与野生型小鼠相比，XiapKO小鼠小肠中肠上皮分化主要调节因子的表达没有变化（图S2B）。这表明XiapKO小鼠Paneth细胞数量的减少是由于细胞死亡而不是上皮细胞分化的改变。

Paneth细胞分泌Wnt因子、Notch配体和支持肠干细胞（ISC）的生长因子，特别是在缺乏这些因子的非上皮来源的条件下，如肠上皮类器官。根据这些数据，随着Paneth细胞数量的减少，与野生型小鼠相比，XiapKO小鼠的隐窝上皮细胞在体外显示出肠上皮类器官形成减少（图2A）。在体内，存在多余的Wnt和生长因子的非上皮来源，因此Paneth细胞对ISC存活和功能的重要性较低。为了研究XiapKO小鼠体内Paneth细胞缺失是否会影响ISC，我们研究了在Lgr5启动子（Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠）控制下表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的XiapKO和WT小鼠的肠上皮增殖和定量的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5+）ISCs。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的干细胞支持相关因子的粘膜表达没有变化（图2B），ISC数量没有变化（图2C），在组成条件下上皮细胞增殖没有变化（图2D）。总之，这些数据表明，Xiap缺乏与Paneth细胞的选择性丧失和Paneth细胞衍生抗菌肽的表达减少有关，而其他分泌性IEC和ISC不受Xiap丧失的影响。

我们接下来研究了是否在XIAP突变患者中也观察到Paneth细胞丢失，因此我们评估了存在或不存在XIAP突变的活动性回肠CD患者的Paneth细胞数量。为此，对10例有XIAP突变的CD患者（图S3A）和28例无XIAP突变的匹配的CD患者的回肠切片进行了分析。作为对照，我们纳入了14名健康人，他们接受了结肠镜筛查，没有宏观或微观炎症证据。患者的临床特征如表S1所示。观察到7种不同的XIAP突变，包括五种与主环缺失相关的无义突变（E99X、L167X、V279TfsX291、W323X和R381X）和BIR2（A216T）和BIR3结构域（K293T）中的错义突变（图S3A）。包括E99X、V279TfsX291和R381X变体在内的先前研究表明，环状结构域缺失的人类XIAP变体对TNF-和TLR诱导的细胞死亡和NOD功能丧失具有易感性。此外，我们之前已经显示XIAP K293T功能受损。有和没有XIAP突变的CD患者在回肠炎症的组织学严重程度方面没有差异（图S3B），我们也没有观察到回肠炎的组织学严重程度与Paneth细胞数量之间的相关性（图S3C）。

然而，与小鼠实验结果一致的是，与未发生XIAP突变的CD患者相比，具有XIAP突变的CD患者的Paneth细胞数量减少（图2E）。值得注意的是，对先前证明影响Paneth细胞的其他基因（如ATG16L1、NOD2、IRGM、XBP1和LRRK2）的测序仅显示了常见的变异【次要等位基因频率（MAF）>0.01】，其中大部分被归类为良性（表S2）。确定的两种潜在破坏性变体（LRRK2和XBP1）是常见的（MAF>0.01），在具有XIAP突变的CD患者中发现为杂合状态，并且先前在健康个体中观察到为纯合状态（表S2）。因此，这些变体不太可能解释Paneth细胞数量减少的原因。总之，虽然只有有限数量的XIAP突变患者进行了分析，因此必须谨慎解释结果，但我们的研究结果表明，与小鼠的XIAP缺陷相似，人类XIAP突变与Paneth细胞的丢失有关。

图1. Xiap缺乏与Paneth细胞丢失和Paneth细胞形态改变有关。

（A） Paneth细胞相关基因表达通过qPCR在XiapKO小鼠回肠中测定，以WT小鼠的百分比表示（每组4到8只小鼠）。中位数+四分位数范围如图所示。（B） WT（n=7）、XiapKO（n=9）和XiapRING（n=6）小鼠中溶菌酶阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量。溶菌酶显示为红色，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）显示为蓝色。比例尺，20 μm.（C）正常（n）、减弱（dim）、弥漫（dif）的Paneth细胞百分比，或Paneth细胞（左）和WT（n=8）、XiapKO（n=8）和Xiap的代表性图像（右）中含有溶菌酶的分泌颗粒的无序（dis）分布D环（n=7）只小鼠。中位数+四分位数范围。

WT小鼠（n=6）和XiapKO小鼠中Paneth细胞的10 μm.（D）EM标尺（n=6）。在XiapKO小鼠中，观察到Paneth细胞颗粒的异常基底外侧定位（中间，红色箭头；隐窝腔位于左下角）、自吞噬体的积聚（中间，红色箭头）和线粒体结构的丢失（右边，红色箭头）。星号指示窗格单元格之间的ISC。红色箭头显示正常线粒体（右）。红线突出显示所示Paneth细胞的质膜。比例尺，10 μm（左），5 μm（中间）和1 μm（右）。右侧显示了EM结果的量化。（E） 在WT（n=10）和XiapKO（n=5）小鼠中，切割的半胱天冬酶-3（cCasp3）阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量。cCasp3显示为绿色，溶菌酶（Lyz）显示为红色，DAPI显示为蓝色。

箭头表示cCasp3正Paneth电池。比例尺，20 μm（F和G）WT[（F）n=9；（G）n=10]和XiapKO[（F/G）：n=10]小鼠小肠中粘蛋白2（Muc2）-阳性杯状细胞（F）和嗜铬粒蛋白A（Chga）-阳性肠内分泌细胞（G）的定量（左）和代表性图像（右）。Muc2（F）和Chga（G）以绿色显示，DAPI以蓝色显示。箭头表示Chga阳性细胞（G）。比例尺，100 μm。（H）通过qPCR在WT小鼠（Muc2/Alp1:n=8；Chga:n=7）和XiapKO小鼠（n=8）回肠中测定的指示基因的相对mRNA表达。在（B）和（D）至（H）中，符号表示单个小鼠，条形表示中位数。采用双尾Mann-Whitney U检验（A和D到H）或Kruskal-Wallis检验，然后采用Dunn多重比较检验（B和C）计算P值。（A）至（E）中的数据基于对2至4只独立窝鼠的综合分析，而（F）至（H）中的数据代表了2至3个独立实验。

图2. 体内XiapKO小鼠的ISC数量和功能未改变，XIAP突变患者的Paneth细胞减少。

（A）根据最初播种的隐窝数量，在培养第7天对WT（n=3）和XiapKO（n=3）小鼠的小肠中衍生的类有机物进行三次播种后的定量。（B） qPCR测定的WT（n=6）和XiapKO（n=6）小鼠中参与支持ISCs的Paneth细胞衍生因子的回肠表达。（C） 在Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2背景下，WT（n=6）和XiapKO（n=8）小鼠回肠中表达Lgr5-eGFP的干细胞的定量（左）和代表性图像（右）。

eGFP显示为绿色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20 μm。（D）WT（n=8）和XiapKO（n=8）小鼠（左）和代表性图像（右）中增殖Ki-67+IECs的定量。Ki-67显示为绿色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20 μm。（E）健康对照参与者（HC）和未发生XIAP突变的CD患者[XIAPWT，n=14（HC），n=28（CD）]和发生XIAP突变的CD患者（XIAPMUT，n=10）中溶菌酶阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量。符号表示单个小鼠（A到D）或患者（E），条形表示平均值（A）或中位数（B到E）。P值采用非配对双尾Student’s t检验（A）、Mann-Whitney U检验（B-D）或Kruskal-Wallis检验，然后采用Dunn多重比较检验（E）进行计算。（A）中的数据代表了三个独立的实验。（B）至（D）中的数据基于对2至3只独立窝鼠的累积分析。

  2 XiapKO小鼠的Paneth细胞死亡依赖于微生物群、TNFR1、RIPK1和RIPK3

接下来，我们用XiapKO小鼠研究了Paneth细胞死亡的机制。在树突状细胞中，XIAP通过TLR配体和TNF限制细胞死亡。因此，我们研究了共生微生物群和TNF信号在Paneth细胞死亡中的作用。与SPF条件下的小鼠相比，与GF-WT同窝小鼠相比，无菌（GF）小鼠的XIAP缺失与Paneth细胞数量减少或Paneth细胞相关基因表达减少无关（图3A和图S4A）。此外，与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的类器官形成减少（即，相同数量的类器官形成数量减少；图2A），与Paneth细胞数量减少一致，类器官在没有微生物群的情况下在体外显示正常生长和扩张（图3B），Paneth细胞数量不变（图3C），Paneth细胞相关基因的表达未受影响（图3D），这与XiapKO小鼠Paneth细胞死亡的微生物触发因素的需要一致。

为了阐明TNF信号在Paneth细胞丢失中的作用，XiapKO老鼠 与Tnfr1−/−老鼠杂交。与GF小鼠中的观察结果类似，TNF受体1（TNFR1）的缺失阻止了Paneth细胞的丢失（图3E）和Paneth细胞相关基因（图S4B）的表达减少，以响应Xiap的缺失。因为RIPK3可以作为TNF诱导细胞死亡的介质，我们将RIPK3−/−与XiapKO小鼠杂交研究RIPK3在XiapKO小鼠Paneth细胞死亡中的作用。与Tnfr1缺失类似，Ripk3缺失可防止XiapKO小鼠的Paneth细胞丢失（图3F和图S4C）。鉴于RIPK3参与Paneth细胞死亡，我们进一步研究了RIPK1依赖性坏死性下垂的抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）是否能够预防XiapKO小鼠的Paneth细胞丢失。鉴于Nec-1不影响WT小鼠中的Paneth细胞数量，这与构成条件下不存在坏死性Paneth细胞死亡有关（图3G），Nec-1可防止XiapKO小鼠中的Paneth细胞丢失（图3G和图S4D）。总之，这些数据表明XIAP限制TNF-和RIPK1/3-依赖性Paneth细胞死亡，以响应来自共生微生物群的信号。

 图3. XiapKO小鼠的Paneth细胞丢失依赖于微生物群、TNF、RIPK1和RIPK3。

（A） GF-WT（n=6）和GF-XiapKO（n=8）回肠中溶菌酶阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量分析。溶菌酶显示为红色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20 μm。（B）来自WT（n=3）和XiapKO（n=3）小鼠的小肠类器官的生长（随时间的大小），每三份分析一次，最大直径为每三份分析10个类器官。显示了平均值±SEM。（C） 溶菌酶（Lyz）-阳性Paneth细胞（左）和小肠类器官的代表性图像（右）的定量，这些细胞以三份形式接种，每只WT（n=4）和XiapKO（n=4）小鼠分析五到七个类器官。

溶菌酶显示为红色，裂解的半胱天冬酶-3显示为绿色，DAPI显示为蓝色。比例尺，100 μm。（D）根据qPCR测定，来自WT（n=3）和XiapKO（n=3）小鼠的类器官中的Paneth细胞相关基因的表达，以三份种子接种。（E和F）XiapWT Tnfr1+/+（n=7）、XiapKOTnfr1+/+（n=9）、XiapWT Tnfr1−/− 回肠中溶菌酶阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量（n=10）和XiapKO Tnfr1−/−（n=9）（E）和XiapWT Ripk3+/+（n=4），XiapKO Ripk3−/− （n=8），XiapWT Ripk3−/− （n=9）和XiapKO Ripk3−/− （n=9）。（F）溶菌酶显示为红色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20 μm。（G）用溶媒或Nec-1（4）腹腔内处理WT和XiapKO小鼠每天（g/g体重），持续14天。

显示了WT（溶菌酶载体：n=5；Nec-1:n=6）和XiapKO小鼠（溶菌酶载体：n=5；Nec-1:n=4）回肠中溶菌酶阳性Paneth细胞（左）和代表性图像（右）的定量。溶菌酶显示为红色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20 μm、 符号表示单个小鼠（A和E至G）或类器官制剂（B至D），条形表示中位数（A和C至G）。采用双尾Mann-Whitney U检验计算P值。数据基于对2到4只独立窝鼠的累积分析。 

3 XiapKO小鼠的Paneth细胞改变与共栖微生物群控制受损相关

Paneth细胞分泌抗菌肽并有助于控制共生微生物群。因此，我们研究了XIAP的丢失是否与微生物控制缺陷有关。与野生型小鼠相比，XiapKO小鼠的隐窝在存在来自XiapKO的隐窝上清液的情况下，细菌生长[菌落形成单位（CFU）]增加，证明了抗菌肽的表达降低，由此证明，来自XiapKO小鼠的隐窝体外抗菌活性降低（图4A）。此外，刺激抗菌肽分泌的胆碱能激动剂氨甲酰胆碱（CCh）促进了来自WT而非XiapKO小鼠的隐窝的抗菌活性（图4A）。为了研究XiapKO小鼠的Paneth细胞丢失是否与体内微生物控制受损有关，使用通用16S核糖体DNA（rDNA）寡核苷酸通过qPCR评估肠道细菌负荷。

与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠回肠中粘膜相关的16S rDNA拷贝数增加（图4B），结肠中类似但不显著的趋势与Paneth细胞衍生抗菌肽在结肠中的远端效应一致（图4C）。与组织相关微生物群的控制缺陷相一致，荧光原位杂交（FISH）和通用16S核糖体RNA（rRNA）真细菌探针（Bact 338）证明了XiapKO小鼠肠道隐窝的密集细菌定植，而WT小鼠的肠腔中的细菌大部分被限制（图4D）。总之，这些数据表明XiapKO小鼠的Paneth细胞改变与共生肠道微生物群分层缺陷相关。

改变抗菌肽的释放可导致肠道微生物群的改变。因此，我们研究了XiapKO小鼠的Paneth细胞改变是否与细菌群落结构的改变以及细菌分层缺陷有关。转录活性组织相关微生物群的16S rRNA测序显示，与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的α多样性没有改变（图4E）。然而，与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠回肠组织粘附微生物群的群落结构不同（图4，F和G）。

具体而言，XiapKO小鼠表现出Deltaproteobacteria（Wilcoxon，P=0.005）和拟杆菌（Wilcoxon，P=0.02）的相对丰度增加，厚壁菌（Wilcoxon，P=0.04）的相对丰度减少（图4，F至H）。这些发现与最近关于 Nod1-/-和 Nod2-/-小鼠的报告不同，后者显示微生物组成没有差异 ，表明XiapKO小鼠的失调不是NOD1或NOD2信号改变的结果。因此，XiapKO小鼠的Paneth细胞改变与肠道微生物群分层和群落结构的改变相关。然而，在SPF条件下，这些改变不足以引起肠道炎症（图S1，A至D）。

图4. Xiap缺乏与微生物控制的改变有关。

（A）与野生型同窝小鼠（每组4只）相比，来自XiapKO小鼠的隐窝上清液的抗菌活性降低（每组4只）。用载体或氨甲酰胆碱（CCh）刺激隐窝，稀释的隐窝上清液与大肠杆菌共培养，然后进行细菌培养。细菌被量化为CFU。（B和C）基于WT（n=15）和XiapKO（n=11）小鼠回肠（B）和结肠（C）中细菌16S rRNA基因相对于宿主Actb基因的定量，对细菌负载量进行qPCR分析。（D）在WT（n=7）和XiapKO（n=9）小鼠的结肠中，通过FISH染色（左；Bact 338为红色，DAPI为蓝色）发现含有细菌的隐窝的百分比以及代表性图像（右）。

比例尺，50 μm、 （E至H）Chao1指数（XiapKO与WT）。（E）加权UniFrac分析（P=0.03，XiapKO与WT）（F），主要属及其对应门的相对丰度条形图（G），WT（n=10）和XiapKO（n=6）小鼠同窝小鼠回肠组织转录活性（cDNA）相关微生物群中类杆菌和厚壁菌（H）相对丰度的方框图。在（A）至（D）中，点表示单个小鼠，条形表示中位数。（E）和（H）显示中位数（条形）、四分位间距（方框）和间距（晶须）。使用Mann-Whitney U检验（A到D）或Wilcoxon检验（E、F和H）计算P值。（A）中的数据代表3个独立实验。（B）至（H）中的数据基于对2至4只独立窝鼠的累积分析。

4 XIAP缺乏促进了对环境诱发的肠道炎症的易感性

大多数XIAP突变的患者并没有表现出临床上明显的肠道炎症。这与SPF条件下XiapKO小鼠自发肠道炎症的发生一致，并提示需要额外的因素来诱发炎症。Paneth细胞衍生的抗菌肽在结肠中具有活性，Atg16l1亚型小鼠的Paneth细胞缺陷与环境触发葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的结肠炎症严重程度增加有关。因此，我们研究了XiapKO小鼠对DSS作为肠道炎症触发因子的易感性。

与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠表现出DSS诱导的结肠炎组织学严重程度增加（图5A），与粘膜细胞因子产生增加（图5B）、体重减轻增加（图5C）、死亡率增加趋势（图5D）、结肠长度缩短（图5E）相关，肠系膜淋巴结中细菌DNA含量增加（图5F）。与上皮干细胞室中没有缺陷相一致，DSS处理的XiapKO与WT小鼠相比，上皮细胞增殖不受影响，因此不增加对DSS结肠炎的易感性（图5G）。此外，XiapKO小鼠对DSS结肠炎的易感性增加与T细胞和B细胞无关，并且在重组激活基因1（Rag1）缺陷的背景下观察到类似情况（图S5）。

Paneth细胞缺陷可引起回肠病理，如DSS模型中的绒毛变钝。因此，我们筛选了XiapKO和WT小鼠对DSS反应时回肠绒毛变钝的情况。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的回肠绒毛长度减少（图5、H和I），回肠绒毛宽度增加（图5J），每个绒毛的IEC数量减少（图5K），从而证明XIAP缺乏和由此产生的Paneth细胞缺陷与DSS引起的回肠病理学发展相关。总之，这些结果表明，XIAP调节肠道炎症对环境触发因素的敏感性，并根据这些触发因素形成炎症的区域分布。

XIAP缺乏促进了对环境诱发的肠道炎症的易感性。大多数XIAP突变的患者并没有表现出临床上明显的肠道炎症。这与SPF条件下XiapKO小鼠自发肠道炎症的发生一致，并提示需要额外的因素来诱发炎症。Paneth细胞衍生的抗菌肽在结肠中具有活性，Atg16l1亚型小鼠的Paneth细胞缺陷与环境触发葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的结肠炎症严重程度增加有关。

因此，我们研究了XiapKO小鼠对DSS作为肠道炎症触发因子的易感性。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠表现出DSS诱导的结肠炎组织学严重程度增加（图5A），与粘膜细胞因子产生增加（图5B）、体重减轻增加（图5C）、死亡率增加趋势（图5D）、结肠长度缩短（图5E）相关，肠系膜淋巴结中细菌DNA含量增加（图5F）。与上皮干细胞室中没有缺陷相一致，DSS处理的XiapKO与WT小鼠相比，上皮细胞增殖不受影响，因此不增加对DSS结肠炎的易感性（图5G）。此外，XiapKO小鼠对DSS结肠炎的易感性增加与T细胞和B细胞无关，并且在重组激活基因1（Rag1）缺陷的背景下观察到类似情况（图S5）。

Paneth细胞缺陷可引起回肠病理，如DSS模型中的绒毛变钝。因此，我们筛选了XiapKO和WT小鼠对DSS反应时回肠绒毛变钝的情况。与WT同窝小鼠相比，XiapKO小鼠的回肠绒毛长度减少（图5、H和I），回肠绒毛宽度增加（图5J），每个绒毛的IEC数量减少（图5K），从而证明XIAP缺乏和由此产生的Paneth细胞缺陷与DSS引起的回肠病理学发展相关。

总之，这些结果表明，XIAP调节肠道炎症对环境触发因素的敏感性，并根据这些触发因素形成炎症的区域分布。

XIAP缺陷与微生物群诱导的肠道炎症易感性相关XIAP突变与两种不同的疾病实体：CD和XLP2独立相关。XIAP突变患者中XLP2的发生通常与病毒感染有关，这一观察提出了一个问题，即XIAP缺陷宿主中肠道炎症的触发因素是否同样来自微生物。根据病理生物的定义，这种触发因素有望在遗传易感宿主中选择性地促进炎症。肝幽门螺杆菌是一种能够在遗传易感小鼠（如Il10缺陷小鼠）中选择性诱导肠道炎症的病理生物。因此，我们研究了XiapKO小鼠对肝片吸虫感染的反应。在我们最初的XiapKO群体中，小鼠携带的幽门螺杆菌属丰度较低（图4G）。

16S rRNA测序显示，这些幽门螺杆菌属与Helicobacter ganmani（一种不能引起肠道炎症的良性幽门螺杆菌）具有100%的序列一致性。由于H.ganmani的定植阻止了WT和XiapKO小鼠与幽门螺杆菌的定植，我们在SPF条件下重新驱动XiapKO和WT小鼠，使其不含幽门螺杆菌，然后将这些小鼠暴露于肝片吸虫。根据XiapKO小鼠的Paneth细胞缺陷和微生物群控制受损，与WT小鼠相比，XiapKO小鼠的肝片梭菌感染与回肠粘膜（图6A）和肠系膜淋巴结（图6B）中肝片梭菌数量增加有关。此外，在感染后的不同时间，与野生型小鼠相比，XiapKO小鼠的派尔斑数量增加（图6C）。XiapKO小鼠的肝片吸虫感染进一步与回肠肉芽肿的形成相关，而在WT小鼠中未观察到此类病理学（图6D）。

为了探讨XiapKO小鼠对肝片吸虫的易感性是否是由于Paneth细胞缺陷和相关的抗菌肽缺乏所致，我们用表达人防御素5（HD5；DEFA5）的腺病毒治疗小鼠，这是一种以前证明可在Paneth细胞缺陷小鼠中恢复抗菌免疫的抗菌肽。腺病毒被用作运载系统，因为它们以IECs为靶点，允许上皮基因表达的恢复。与这些数据一致，服用Ad-HD5与回肠HD5表达增加有关（图S6）。

因此，我们评估了腺病毒HD5的表达是否能够促进XiapKO小鼠的肝片吸虫清除，并保护其免受肝片吸虫相关回肠病变的影响。接受表达半乳糖苷酶的对照腺病毒（Ad-LacZ）的XiapKO小鼠显示肝H. hepaticus清除缺陷（图6、E和F），派尔斑数量增加（图6、G和H）。回肠肉芽肿的发生（图6、I和J），类似于未经腺病毒治疗的XiapKO小鼠。相反，Ad-HD5转导XiapKO小鼠的肝细胞清除率恢复到WT小鼠（图6、E和F）阻止了派尔斑的数量增加（图6、G和H），并阻止了XiapKO小鼠回肠肉芽肿的形成（图6、I和J）。这些数据表明，抗菌肽表达的恢复可防止XiapKO小鼠对肝片吸虫的易感性。此外，这些发现证实了在XiapKO小鼠中观察到的Paneth细胞缺陷与H. hepaticus易感性之间的机制联系。

 图5. 在DSS模型中，Xiap缺乏与结肠炎症的严重程度增加以及DSS引起的回肠病理改变有关。

（A和B）WT（n=10）和XiapKO（n=10）小鼠给予2.5%DSS 5天，并在DSS停止后5天进行分析。（A）结肠组织病理学评分（左）和代表性H&E图像（右）。比例尺，50 μm。（B）通过qPCR测定的结肠粘膜细胞因子表达。（C至F）WT和XiapKO小鼠在三个周期中给予2.5%DSS，并在第三个DSS周期中DSS中断后2天进行分析。体重[（C）；表示为初始体重的平均值±SEM；体重：n=26；XiapKO：n=26]，存活率[（D）；体重：n=26；XiapKO：n=26]，结肠长度[（E）；体重：n=24；XiapKO：n=14]，显示了基于WT（n=10）和XiapKO（n=7）小鼠（F）肠系膜淋巴结中细菌16S rRNA基因相对于宿主Actb基因的定量的细菌载量的qPCR分析。（G）用2.5%DSS治疗WT（n=14）和XiapKO（n=9）小鼠5天，并在DSS停药5天后分析所有CEC中Ki-67+结肠上皮细胞（CEC）的数量（左）。代表性图像显示在右侧面板中。Ki-67显示为绿色，DAPI显示为蓝色。

比例尺，100mm、 （H至K）WT（n=9）和XiapKO（n=9）小鼠用2.5%DSS治疗5天，并在DSS停药2天后进行分析。显示了WT和XiapKO小鼠回肠的代表性H&E染色图像。（H）回肠中绒毛长度（I）、绒毛宽度（J）和每绒毛IEC数（K）的定量。比例尺，100 μm。在（A）、（B）、（E）至（G）和（I）至（K）中，符号代表单个小鼠，条形图表示中位数。采用双尾Mann-Whitney U检验（A到C，E到G，I到K）和对数秩检验（D）计算P值。数据是两到三个独立实验的代表。

图6.Xiap缺乏与肝吸虫感染易感性相关。

（A至D）用肝片吸虫（H.H.）灌胃WT和XiapKO小鼠，并在指定时间点进行分析。（A和B）基于qPCR的回肠粘膜中肝片吸虫定量检测[（A）；感染后2周（p.i.）；WT，n=8；XiapKO，n=8]和肠系膜淋巴结（MLN）[（B）；感染后4周；WT，n=8；XiapKO，n=6]。（C）感染后2周（左）和12周（右），与WT（n=8）小鼠相比，XiapKO（n=8）小鼠的派尔斑（PPs）数量。（D） 感染12周后WT（n=8）和XiapKO（n=8）小鼠回肠肉芽肿的评分（左）和代表性图像（右，箭头）。

比例尺，50 μm（左和中）和20 μm（右）。（E和F）感染后2周结肠腔内容物中治疗措施（E）和肝片吸虫16S rDNA的概述[（F）；WT，n=7；XiapKO，n=9]。（G至J）治疗方案（G），感染后12周的PPs数量[（H）；Ad LacZ:WT，n=6；XiapKO，n=4；Ad-HD5:WT，n=9；XiapKO，n=6]，WT和XiapKO小鼠回肠感染后12周肉芽肿（箭头所示）的评分（I）和代表性图像（J）[（I），Ad-LacZ:WT，n=6；XiapKO，n=8；Ad-HD5:WT/XiapKO，n=9]。

比例尺，100 μm、 插图除外（20 μm）。（K）图形摘要。Xiap缺乏与微生物群和TNF依赖的Paneth细胞（PC）死亡相关，导致抗微生物肽的丢失和细菌分层和结构的改变（中间）。尽管这与明显的自发性肠道炎症无关，但暴露于微生物或化学炎症触发物可在这些遗传易感宿主中引发肠道炎症（右图）。符号表示单个鼠标，条形表示中间值。采用双尾Mann-Whitney U检验计算P值。数据代表至少两个独立进行的实验。

讨论

IBD的肠道炎症被认为是由宿主对微生物群反应的改变引起的。然而，微生物信号在遗传易感宿主中促进炎症的具体途径尚不清楚。本研究，我们通过研究与CD和XLP2相关的原发性免疫缺乏症来解决这个问题，其中两种疾病的不完全外显率和微生物元素在淋巴增生性疾病中的既定作用提供了一个独特的模型来描述肠道炎症的微生物触发因素。

我们观察到XIAP的缺失与Paneth细胞对微生物群-、TNF-、RIPK1-和RIPK3-依赖性细胞死亡的易感性相关，导致共生微生物群控制的改变以及肠道细菌分层和组成的缺陷（图6K，中）。与XIAP突变患者中CD的不完全外显率）一致，Paneth细胞缺陷和失调不足以引起肠道炎症，而是在这种遗传易感性的背景下提供了对能够选择性促进炎症的病理生物的易感性（图6K，右图）。值得注意的是，Wahida及其同事独立观察了我们研究的中心发现，包括XiapKO小鼠的TNFR1-和微生物群依赖性Paneth细胞功能障碍和肠道炎症，他们报告了在非SPF条件下维持的XiapKO小鼠自发的微生物群依赖性小肠炎症，而SPF或GF对这些小鼠的再抑制以及与WT小鼠的共住消除了炎症。

总之，这些发现说明了宿主基因的改变如何引起对肠道炎症的特定微生物触发因素的易感性并有助于解释在XIAP突变携带者中观察到的CD不完全外显率。此外，通过施用抗菌肽预防微生物群诱导的炎症表明，抗菌免疫的治疗性恢复和疾病相关微生物元素的潜在直接靶向可能提供预防或治疗肠道炎症的功效。尽管这与XIAP突变的患者特别相关，但与自噬缺陷、内质网应激、线粒体功能障碍、PRR信号传导和细胞死亡相关的宿主遗传学的其他改变同样影响Paneth细胞功能，这表明我们的发现的意义不仅仅局限于XIAP突变的个体。

我们的数据也支持Paneth细胞缺陷在CD发病机制中的中心作用的概念。内质网应激、Paneth细胞内选择性自噬缺陷和线粒体功能障碍足以诱发小鼠CD样肠道炎症，因此表明Paneth细胞缺陷在CD发病机制中起主要作用。我们观察到，与XIAP突变相关的孟德尔形式的CD通过Paneth细胞缺陷促进了对微生物群依赖性回肠炎症的易感性，这与这些数据以及Paneth细胞改变对CD的中心贡献的概念是一致的。然而，IBD的长期缓解，包括因异基因干细胞移植而导致XIAP突变的个体患者的微生物组成恢复，表明来自造血室的额外重要线索，这有助于炎症过程。

根据这一概念，XIAP限制炎性细胞因子（如IL-1）的髓样生成TNF，其缺失可能导致TNFR1依赖性Paneth细胞丢失。此外，在本期《科学免疫学》（Science Immunology）中，Wahida等人证明了在XiapKO小鼠中，除了TNFR1依赖性Paneth细胞功能障碍外，树突状细胞的TNFR2依赖性炎性细胞死亡，并进一步证明TNFR1或TNFR2的缺失足以预防肠道炎症。总之，这些发现表明上皮细胞和髓样细胞在XIAP缺乏症的肠道炎症中起作用。

总的来说，我们的工作揭示了一条对Paneth细胞稳态和肠道微生物群控制至关重要的途径。人类XIAP功能缺失突变或小鼠XIAP基因缺失导致该通路中断与Paneth细胞广泛缺陷相关，并促进对肠道炎症微生物触发因素的敏感性。总之，我们的发现为孟德尔型IBD的发病机制提供了新的见解，支持了Paneth细胞在CD发病机制中的核心作用的概念，并强调了微生物靶向在IBD预防和治疗中的新机会。

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