精准前沿丨多组学预测黑色素瘤免疫检查点抑制剂治疗疗效

本期《精准前沿》栏目分享澳大利亚悉尼大学Georgina V. Long及其课题组发表于Cancer Cell（IF = 35.88）上的一篇研究[1]，该研究纳入77名接受免疫治疗的晚期皮肤黑色素瘤患者，对基线肿瘤进行全基因组、转录组、甲基化测序，结合免疫组化探究治疗疗效的预测指标。结果表明，高肿瘤突变负荷（TMB）、新抗原负荷、IFNγ相关基因的表达、程序性死亡配体表达、低PSMB8甲基化以及肿瘤微环境中的T细胞含量与免疫疗法的反应有关。结合TMB和IFNγ相关基因表达的多变量模型可以有力地预测治疗疗效。具有高TMB和高IFNγ特征的肿瘤对免疫疗法最敏感。

研究背景

检查点抑制剂已经彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗，最近的研究结果显示对高风险的早期患者也有好的疗效。对于晚期黑色素瘤患者，检查点抑制剂免疫疗法在大量患者中显示出持久的应答，在临床试验人群中，联合免疫疗法的5年总生存率高达52%。然而，尽管如此，大多数晚期黑色素瘤患者由于先天或后天免疫治疗的耐药性，仍然死亡率较高。目前，对免疫疗法的抵抗机制仍然知之甚少。概括地说，具有T细胞浸润、高程序性死亡配体 (PD-L1) 表达和干扰素γ (IFNg) 特征的所谓“热肿瘤“，对治疗有反应，而”冷肿瘤“（即肿瘤微环境中没有T细胞）出现治疗抵抗。该团队先前大型患者队列中研究证明EOMES+ CD69+ CD45RO+ 效应记忆T细胞与抗PD1免疫治疗联合有或没有抗CTLA-4治疗（IPI）的反应密切相关。已有研究探索了基线（治疗前）肿瘤标本中的突变、基因表达和蛋白质表达数据，以识别与免疫治疗反应相关的生物标志物。已确定的耐药机制，包括JAK突变、PTEN缺失、抗原呈递缺失、WNT/b-连环蛋白过表达、新抗原异质性、T细胞功能障碍和非冗余信号通路。然而，这些事件发生频率低，并且在治疗抵抗的患者中具有高度异质性。

该研究使用治疗前黑色素瘤患者的组织活检样本，探究晚期黑色素瘤患者对PD1以及联合PD1和CTLA-4检查点抑制剂治疗的反应和耐药情况。使用全基因组测序 (WGS)、RNA 测序 (RNASeq)、甲基化组分析和免疫组织化学 (IHC) 将来自该患者队列的肿瘤基因组、转录组、甲基化组和免疫细胞浸润与治疗反应以及其他临床数据相关联。系统评估了新的和先前发表的对治疗反应的生物标志物，并探索了可能的耐药机制。  

研究设计

样本设计：从77名晚期皮肤黑色素瘤患者中收集了治疗前的肿瘤活检样本，这些患者接受单独PD1（纳武利尤单抗或派姆单抗，n = 53）或PD1联合IPI（n = 24）。从活检到免疫治疗开始的中位时间为5.2个月。肿瘤主要来自皮下（56%）和区域淋巴结（30%）部位。

研究设计：

1. 测序方法：所有肿瘤和匹配的胚系DNA样本都经过WGS（n = 77）；部分患者肿瘤样本进行RNASeq（n = 53）、使用Illumina EPIC 甲基化阵列进行甲基化分析（n = 43），以及免疫组化（n = 41）。

2. 疗效评估：根据RECIST 1.1 (Eisenhauer et al., 2009)评估患者对治疗的反应。治疗响应组（n = 50）定义为RECIST完全反应（CR）、部分反应（PR）或疾病稳定（SD）超过6个月；治疗抵抗组（n = 27）定义为RECIST进展为最佳反应或SD少于6个月。

3. 生存结局评估：总体生存期OS以及无进展生存期PFS。  

研究结果

1. 高肿瘤突变负荷、低结构变异负荷和高新抗原负荷与良好的反应相关

首先探索了每个样本中体细胞单核苷酸变异 (SNV)、结构变异 (SV) 和拷贝数改变 (CNA) 的总体负担，以及突变特征（例如，紫外线辐射 [UVR] 暴露的特征）对免疫检查点治疗反应的影响（图 1A）。结果显示：较高的肿瘤突变负荷 (TMB)，对任何治疗（PD1或IPI + PD1）的总体反应都代表着治疗敏感（图 1B）。相反，具有更多SV的患者显示出治疗抵抗（图 1C）。同时，CNA 负担在抵抗组也呈现更高的趋势（图 1D）。当根据治疗类型（PD1或IPI + PD1）进行分层分析时，TMB仅与PD1反应有关，而SV计数与IPI + PD1反应相关，但是趋势是一致的。由于肿瘤来源于多个部位，研究者还单独检查了皮下肿瘤（占肿瘤的 56%）中的TMB，发现与之前的观察结果一致。

接下来，根据癌症体细胞突变目录 (COSMIC) 数据库探究突变特征，结果显示治疗反应与大多数肿瘤中占主导地位的UVR特征（SBS7a、SBS7b 和 SBS7c）未显示出关联，但没有UVR特征的SBS38和SBS5在反应不佳的患者中更常见。治疗反应与全基因组重复的存在没有关联（图 1A）。染色质碎裂和其他复杂的重排事件在治疗抵抗的患者中更为常见（图 1A），这与更多的结构变异结果一致。比较预测的表达新抗原数量，结果显示TMB和表达的新抗原计数之间存在很强的正相关性。新抗原负荷在对任何治疗的治疗敏感组中显著高于抵抗组，在单独的PD1治疗上也是一样的结果，但是对于IPI + PD1治疗组没有显著差异（图 1E 和 1F）。

在这里，作者想要探究是否有突变能够有效预测免疫治疗反应，但是很遗憾未有发现。

图1. 高肿瘤突变负荷、低结构变异负荷和高新抗原负荷与良好的反应相关  

2. 干扰素和T细胞受体信号通路在应答者中富集

作者对53个患者的肿瘤组织进行了RNA测序，对于治疗响应组和抵抗组进行了差异表达和富集分析，得到了205个显著差异表达的基因集，其中包括了与免疫治疗反应相关的基因：CD274, STAT1,IFNG, GZMA, PRF1, GZMB, 以及CD8A。IFNγ response通路在治疗相应组组中被富集，治疗抵抗组未有富集通路（图2A）。

进一步对43例样本进行了DNA甲基化测序，对治疗响应组和抵抗组进行了差异CpG位点筛选，729474个探针位点中仅有5个有显著差异，这可能是由于样本量小且有异质性导致的。并且这5个位点均不在基因的启动子区域。接下来，作者从新的角度去研究DNA甲基化水平，通过观察RNA数据中找到的205个差异表达基因的甲基化水平，其中41个基因有5个及以上的探针，对这41个基因的多个探针以中值为标准进行计算。最终筛选出127个基因对应的568个探针落在基因的启动子区域，并且与甲基化水平与表达负相关。这127个基因中，PAMB8的两个探针均与表达显著负相关，并且在治疗响应和抵抗组中有显著差异，这与以往报道一致。

探究以往研究中与免疫治疗密切相关的基因集在治疗良好和不佳组中的表达（图2B），结果显示：6-基因的IFNγ特征，18-基因的IFNγ特征，效应T细胞特征，IFNγ/效应T细胞联合特征，趋化因子特征，肿瘤免疫功能障碍和TIDE免疫预测指标均显示出在治疗响应组中显著高于抵抗组 (图2C-H)。同时，IFNγ效应T细胞，以及趋化因子特征与更好的无进展生存期密切相关。

图2. 干扰素和T细胞受体信号通路在应答者中富集

3. CD8+T细胞、M1巨噬细胞和溶细胞活性定义了应答者的免疫微环境

通过免疫细胞的marker去解析样本的肿瘤微环境。首先使用CIBERSORT基于RNA数据评估免疫细胞浸润程度（图3A）。比较治疗反应良好和不佳组各类型免疫细胞的浸润程度，结果显示：治疗响应组中M1型巨噬细胞和CD8+T细胞的浸润程度显著高于抵抗组（图3B-C）。接下来，使用methyICibersort基于DNA甲基化数据评估CD8+T细胞浸润程度，结果同样显示在治疗响应组中浸润程度更高（图3D）。溶细胞活性在CD8+T细胞激活时上调，其活性可以基于两个基因 PRF1 和 GZMA表达进行评估，结果显示在治疗响应组中显著高表达（图 3E）。联合PRF1 和GMZA甲基化水平结果表明，这两个基因的较低甲基化（基因高表达）也与治疗敏感正相关（图3F）。多重免疫组化结果同样验证了CD8+T细胞含量与治疗响应相关，并且其主要存在与肿瘤内（瘤内细胞毒性T细胞密度），同时瘤周也有CD8+T细胞富集的趋势（图3G）。最后，通过评估RNA数据的PD-L1表达，免疫组化结果，以及DNA甲基化水平，结果显示RNA水平和IHC结果均在治疗响应组中显著高表达且与PFS良好预后相关，而甲基化水平无显著相关性（图3I）。

图3. CD8+T细胞、M1巨噬细胞和溶细胞活性定义了应答者的免疫微环境  

4. TMB以及IFNγ-6得分作为独立疗效预测因子，效能超过临床指标

通过研究TMB与IFNγ-6以及CD8+T细胞的关系，结果发现这些结果没有显著关联性，这与之前的研究一致，也证明了IFNγ-6以及CD8+T细胞可作为独立于TMB的预测指标。为了进一步证实这一点，收集了53名患者的分子标记和临床数据，建立了预测反应的回归模型。首先，建立了基于分子标记（TMB、SV负荷、肿瘤纯度、上述几种表达特征、溶细胞活性和CD8+T细胞密度）和基线临床因素的单变量模型。由于TMB是最强的单变量预测因子，接下来使用TMB和来自单变量分析的其他重要因素建立了双变量模型。基于TMB+IFNγ /T细胞表达的模型都显示出相似的预测性能，基于TMB和IFNg-6评分的模型预测性能最好。总的来说，这三种指标都能预测免疫治疗反应，但在联合使用时预测效果更好，AUC可以达到0.84（图4A和5A)。因此，同时具有高TMB和高IFNg-6得分的肿瘤对免疫治疗的反应最好，并且与更长的PFS（图 4B）和更长的OS相关（图 4C)。这一结论在60个III期黑色素瘤患者的验证队列中也得到了验证（图4D）。

图4.TMB以及IFNγ-6得分作为独立疗效预测因子

5. 探究预测指标未能准确预测的患者肿瘤特征

对于未能通过TMB/IFNγ-6模型进行准确预测的12个患者，作者对他们的肿瘤和临床特征进行了分析解读。有 8 名患者预测结果为响应，但实际反应不佳（图 5A 和 5C），其中 7 人接受了PD1单药治疗，他们与正确预测的响应者没有明显的共同分子特征（图 5C）。第 8 名患者 (MELA_0388) 具有潜在的抗性生物学机制，即 JAK3 剪接突变（和低 JAK3 基因表达），已被Ghoreschi 等人证明可以消除细胞因子对免疫细胞的刺激。有四名患者表现出TMBhiIFNγ-6lo，四名表现出TMBloIFNγ-6hi。TMBloIFNγ-6hi的四名患者均在 2.2 个月内出现了疾病进展。其中 3 人的肿瘤中没有 PD-L1 表达，但是具有可变的肿瘤浸润淋巴细胞 [TIL] 或溶细胞活性，这可能解释了对基于抗 PD-1 的治疗的先天耐药性。与这四名快速进展的患者不同，四名TMBhiIFNγ-6lo的患者进展较晚，进展时间在 2.7 个月至 5.5 个月之间。其中三名患者患有促纤维增生性黑色素瘤（MELA_0608、MELA_0413 和 MELA_0430），此前有报道表明，由于该类型患者具有高TMB特征，对免疫检查点抑制剂反应良好。

有四名患者使用模型预测显示治疗抵抗，但实际治疗是敏感的（MELA_0441、MELA_0366、MELA_0383 和 MELA_0552）（图 5A 和 5C）。所有患者均为TMBhiIFNγ-6lo 肿瘤，并在初始反应后出现获得性耐药（SD > 6 个月，PR 或 CR）（图 5C）。其中三个是未接受过治疗的，这与发现队列（n = 53）中的结果一致，即未接受 BRAFi/MEKi 的患者反应更好。

图5. 预测指标未能准确预测的患者肿瘤特征  

讨论

该研究从多组学层面探究了免疫治疗疗效预测的生物标记物。整合了全基因组，转录组，甲基化并联合免疫组化，对PD-1治疗/联合PD-1,CTLA-4治疗的患者队列进行了全面的解读并建立了预测模型。通过对DNA、RNA、甲基化阵列、IHC和临床数据的多因素评估，我们发现肿瘤微环境中TMB、新抗原负荷、IFNγ表达、PD-L1表达和 CD8+T细胞与免疫治疗反应密切相关。WGS和甲基化分析识别出与不良反应相关的特征，包括大量的结构重排，以及个体中存在的局部复杂事件，如染色体碎裂，以及PSMB8启动子的高甲基化（PSMB8基因低表达）。

和以往研究结果一致，高TMB和IFNγ相关基因表达不相关，并且各自独立预测反应。TMB+IFNγ联合预测模型显示出超过了临床指标的预测性能。然而，与反应不佳者（特异性53%）相比，该模型在预测反应良好组（敏感性 89%）性能更好。该模型在预测无应答组表现不佳的原因可能是耐药机制的异质性，这是进一步改善治疗结果的最大障碍。研究者们在接受新辅助治疗的III期黑色素瘤患者的 OpACIN-neo 临床试验队列中验证了该模型，表明这一模型稳健且可推广到其他队列，包括那些的非晚期疾病队列。

同时，该研究结果支持这样一个观点：患者对检查点抑制的抵抗具有极大的异质的。研究中发现：以往研究中发现的与免疫治疗不良反应相关的某些分子事件在此次队列中未发现与治疗结局的相关性，包括特定基因的体细胞突变，例如JAK1、JAK2、SERPINB3和BAF/PBAF家族。以及某些基因表达，包括b-连环蛋白，TGFβ，或IPRES分数。这些机制可能在预防个别患者对免疫治疗的反应方面发挥作用，但在无反应的患者中并不是普遍存在的。但是，不同的研究在治疗疗效的分类、患者数量、肿瘤纯度、肿瘤内异质性或肿瘤组织等方面的差异可能也是原因之一。

为了更好地解析不良反应者的异质性，这对于改善治疗结果是必要的，研究者对患者进行了全面的注释和分析，重点关注12名预测错误的患者。结果发现在一线治疗中使用BRAFi/MEKi治疗会导致肿瘤及其微环境的变化，T细胞浸润会减少，并导致PD1耐药性，这与之前已有研究一致。

作者认为该研究受到小样本数的限制，使得观察具有探索性。同时，研究的另一个局限性是，从收集肿瘤活检到开始进行免疫治疗，包括单纯的抗PD-1或者抗CTLA-4治疗，这期间有一部分患者进行了干预治疗。这可能会影响肿瘤及其微环境，使观察到的相关性不太准确。作者认为开展一项更大规模的前瞻性研究具有重要的意义，该研究旨在评估治疗抵抗患者的基因组特征，理想情况下在治疗开始前收集的样本，以便直接推断分子特征与治疗反应之间的联系。

结语

总之，在这项研究中，收集了77例单独使用PD1或IPI+PD1治疗的转移性黑色素瘤患者样本，使用多因素方法，发现了与反应是否响应相关的多个检测指标。同时发现了与治疗抵抗相关的多个事件，包括大量结构重排和局部复杂事件，如显色三联体，以及PSMB8启动子高甲基化。IFNγ和TMB的联合模型对反应具有高度预测性（敏感性为89%），但不能预测耐药性（特异性为53%），并且该模型在独立队列中得到了验证。目前，癌症免疫治疗最大的难点仍然是识别耐药性患者。对于患者间强异质性带来的预测失败的问题，通过结合多病灶分析，以及单细胞测序来进行进一步的探索，可能是获得对耐药性的深入探究的重要方式。 END 

参考文献：  

[1]    Newell F, Pires da Silva I, Johansson PA, et al. Cancer Cell. 2022;40(1):88-102.e7. doi:10.1016/j.ccell.2021.11.012  

撰写丨lulu    

编辑、排版丨SX