专访复旦大学舒易来主任：致力于用基因编辑技术，帮助耳聋患者重返有声世界

耳聋是人类最常见的感官障碍。据世界卫生组织（WHO）报道，全球超过5%的人口，即4.7亿人患有致残性听力障碍（中度及以上的听力障碍），其中3400万是儿童。中国聋儿康复研究中心的数据显示，我国听力障碍人群占人口总数15.8%（约2亿人）；致残性听力障碍患者占总人口的5.2%（约7000万人）。在我国，每年新生约3万聋儿，其中60%与遗传因素相关，目前已发现了150多个基因与耳聋相关，但至今临床上尚无任何可用于治疗遗传性耳聋的药物。 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来主任长期致力于耳聋治疗的研究，主要基于CRISPR-Cas基因编辑及碱基编辑技术，在显性和隐性遗传性耳聋、后天性耳聋的防治上取得了重要突破，为耳聋的治疗开辟了新方向。《生物世界》专访了舒易来主任，通过其取得的研究成果来了解耳聋基因治疗的最新进展和临床前景。 2022年7月21日，舒易来主任联合李华伟教授、杨辉研究员团队，在 Science Translational Medicine 期刊发表了题为：Rescue of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of mini dCas13X-derived RNA base editor 的研究论文【1】。该研究通过基于迷你型dCas13X的RNA单碱基编辑器——mxABE，对 MYO6 基因突变所致的耳聋进行了治疗，成功改善了耳聋模型的听力。这是首个基于RNA单碱基编辑技术治疗显性遗传性耳聋成功的研究，为遗传性耳聋的精准治疗以及临床转化提供了有力的科学证据和新的治疗方向。
舒易来主任告诉《生物世界》，这项研究的创新点主要有两个，其一、研发了在疾病治疗中具有潜在价值的RNA单碱基编辑器；其二、为耳聋提供了新的潜在防治策略。RNA单碱基编辑器，在不切割DNA和RNA的前提下，可实现RNA水平上碱基的精确纠正；另外，相对于DNA编辑工具，可以避免遗传物质永久性改变面临的潜在风险，因此安全性更高，在疾病的治疗上具有优势。既往的基于Cas13b等开发的RNA单碱基编辑器，其大小偏大，不利于体内递送，尤其是无法通过单个AAV载体递送。而这项研究开发了针对显性遗传性疾病的迷你型dCas13X的RNA单碱基编辑器，通过单个AAV实现了体内的递送和编辑，并成功改善了耳聋小鼠模型的听力。
这项研究在递送该RNA单碱基编辑器时，使用了AAV-PHP.eB这一AAV血清型，舒易来主任表示，在耳聋基因治疗中，AAV是目前主要的递送载体，其在体内递送效率方面，优于其他病毒载体以及非病毒载体，且安全性得到了广泛验证。 治疗靶基因  MYO6  主要表达在内耳毛细胞中，团队前期的研究发现，AAV-PHP.eB可以高效感染毛细胞，感染效率大于95%，因此选择AAV-PHP.eB作为递送载体。
舒易来于2010-2014年在哈佛大学医学院从事医学科学研究，于2014年10月与国际著名基因编辑专家David Liu、以及哈佛大学麻省眼耳鼻喉医院Zheng-Yi Chen教授团队合作在 Nature Biotechnology 期刊发表耳聋基因治疗领域的重大突破性研究成果【2】。该研究国际上首次使用 CRISPR-Cas9 蛋白在体外和体内对内耳毛细胞基因基因编辑，为遗传性耳聋的基因编辑治疗奠定了基础。回想起八年前的这项研究，舒主任仍记忆深刻，他告诉《生物世界》，非常有幸和这样一批优秀的科学工作者共同完成这项里程碑的工作，同时也惊叹于David Liu和Zheng-Yi Chen两位教授的敬业和前瞻性眼光。自己当时负责这项研究的体内实验，做了很多探索性实验，记得那天晚上已经接近凌晨，终于第一次发现CRISPR-Cas9在内耳中产生编辑，当时特别高兴，马上邮件告诉两位教授，他们也非常兴奋地回复了我，之后的工作就顺理成章很快完成了。这项研究是CRISPR-Cas9基因编辑技术在听觉领域中的首次研究，不仅是耳聋基因治疗领域的重要突破，也让自己认识到了CRISPR-Cas9基因编辑技术的强大，以及遗传性耳聋能够根治的希望。
因此，回到复旦大学后，自己主要的研究方向就是基因编辑在耳聋防治上的前沿探索以及推动研究成果走向临床转化。
1、显性遗传性耳聋的治疗研究
2021年6月，舒易来主任、李华伟教授和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员等在 Molecular Therapy 期刊发表了题为： Gene editing in a Myo6 semi-dominant mouse model rescues auditory function 的研究论文 【3】 。 该研究使用AAV载体将CRISPR-Cas9基因编辑系统递送到 MYO6 基因突变导致的半显性遗传性耳聋小鼠模型中，通过特异性敲除突变等位基因，改善了耳聋小鼠的听觉功能。这说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术可以实现对半显性遗传性耳聋的基因治疗。 2022年3月，舒易来主任、李耕林研究员、中国农业大学胡晓湘教授合作在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Preventing autosomal-dominant hearing loss in Bth mice with CRISPR/CasRx-based RNA editing  的研究论文【4】 。该研究通过AAV载体递送用于RNA敲低的CRISPR-CasRx系统，将其注射到 Tmc1 基因突变的显性耳聋小鼠模型内耳中，通过敲低突变等位基因的转录本，阻止了小鼠的毛细胞损失及听力丧失。这表明基于CRISPR-CasRx的RNA编辑是治疗常染色体显性遗传性耳聋的有前景的治疗方法。上述这几项显性遗传性耳聋的基因治疗，分别采用了不同的基因编辑工具和策略，包括DNA敲除、RNA敲低，以及RNA单碱基编辑。舒易来主任告诉《生物世界》， 基于不同的CRISPR系统，可对DNA或RNA进行编辑；利用最常用的CRISPR-Cas9系统，可实现DNA的特异性敲除或碱基的精确纠正；利用CRISPR-Cas13等RNA编辑工具，可实现RNA的敲低；而将腺嘌呤脱氨酶与失活的Cas13融合表达，可精确地将碱基A转换为碱基I （其在密码子配对中与碱基G相当），即RNA单碱基编辑工具。RNA编辑相对于DNA编辑而言，可以不改变DNA序列，因此被认为具有更高的安全性。因此在显性遗传性耳聋的治疗策略上，团队在追求治疗效果的同时，也一直在探索更加安全的方式。
2、隐性遗传性耳聋的治疗研究
上述研究，都是针对显性遗传性耳聋的治疗，实际上，在遗传性耳聋中，约80%属于隐性遗传，而治疗这类隐性遗传性耳聋，显得尤为重要，但难度却更大。2022年2月，舒易来主任、李华伟教授与中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员团队合作，在 Cell Research 期刊上发表了题为 ：Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice 的研究论文【5】 。该研究以AAV作为基因治疗的递送载体， 利用HMEJ基因敲入方法精准纠正了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠听觉毛细胞中的点突变 ，恢复了内毛细胞静纤毛形态，并显著改善小鼠的听觉功能长达治疗后6个月。这是首个基于CRISPR/Cas9-HMEJ技术治疗隐性遗传性感音神经性聋成功的研究，为遗传性耳聋的精准治疗以及潜在的临床转化提供了强有力的科学证据。 舒易来 主任表示， 针对隐性遗传性耳聋的基因治疗，目前最快推向临床试验的应该是基因过表达策略。国外目前至少有两家公司及研究团队在推动相关的临床试验，同时我们有一项基因治疗策略也正在推进临床转化中，希望早日造福患者。过表达策略的优势主要包括，其一、已获批上市的基因治疗药物，多数是过表达策略，说明在临床上可行性大；其二，过表达的方式在临床应用上，能够适用于更多不同突变类型的患者。过表达与基因编辑两种策略，二者各有优点，也互相补充。过表达策略在隐性遗传性疾病的治疗上具有很大的潜力，基因编辑策略具有精准、特异性的优势；在显性遗传性耳聋上，基因编辑策略更有优势。在隐性遗传性耳聋上，目前过表达策略在耳聋基因治疗中是走在最前面的可行性方案，基因编辑策略是未来或第二代更具有潜力的耳聋基因治疗方案。
3、后天性耳聋的治疗研究 后天性耳聋
是耳聋患者的重要部分，致聋原因主要包括耳毒性药物、噪音、老化、感染等因素，目前尚无可治疗的药物 （突发性耳聋除外） 。氨基糖甙类抗生素 （aminoglycosides，AGs） 所致耳毒性聋是获得性感音神经性耳聋的主要类型之一。对于需要多疗程静脉用药的患者（例如，结核病和囊性纤维化病患者） ，AGs耳毒性的致病率甚至超过50%，但临床上缺乏有效的防治对策。李华伟/舒易来团队在前期研究中发现 Htra2 基因在新霉素损伤后的耳蜗中表达水平明显上升，可能参与了耳毒性聋的发病。2021年3月，李华伟教授与舒易来主任团队在 Genome Biology 期刊上发表了题为： Prevention of acquired sensorineural hearing loss in mice by in vivo Htra2 gene editing 的研究论文 【6】 。 该研究设计了两种针对 Htra2 基因的CRISPR-Cas9系统（SpCas9和SaCas9系统） ，通过AAV-Anc80L65递送进小鼠内耳，实现在体Htra2基因有效编辑 （DNA敲除） ，促进耳蜗毛细胞存活，显著改善氨基糖甙类抗生素暴露后小鼠的听觉功能。这是国际上首个基于CRISPR-Cas9基因编辑防治后天性感音神经性聋成功的研究。2022年4月，舒易来主任、李华伟教授和陈兵教授团队合作在 Molecular Therapy-Nucleic Acids 期刊发表了题为： Specific knockdown of Htra2 by CRISPR-CasRx prevents acquired sensorineural hearing loss in mice 的研究论文【7】 。该研究以基于CRISPR-CasRx的RNA编辑技术成功防治了耳毒性药物引起的后天性感音神经性耳聋，显著保护了小鼠模型的听觉功能，为CasRx技术在临床的应用提供了重要理论依据。 这些研究证明了 Htra2 是防治药物性耳聋的潜在靶点，以CRISPR-Cas9、CRISPR-CasRx在DNA和RNA水平对 Htra2 基因进行编辑，开发出可以防治氨基糖甙类抗生素导致的耳毒性聋的防治药物，将为其它后天因素如老化、噪声等引起的耳聋的治疗提供新的思路和方案。
4、内耳毛细胞再生的研究
每个人出生后，听觉系统中发挥重要作用的内耳毛细胞的数量都是固定的，不可再生，这些感觉细胞一旦受损就会导致听力下降甚至丧失。除了基因突变遗传因素引起的耳聋，由于环境因素导致的毛细胞损伤，是否有能够再生内耳毛细胞的方法，进而改善或恢复听力呢？ 2019年12月，舒易来主任和哈佛大学Zheng-Yi Chen教授团队等在 Nature Communications 期刊发表了题为： Renewed proliferation in adult mouse cochlea and regeneration of hair cells 的研究论文 【8】。该研究利用腺病毒介导及可诱导的转基因小鼠模型共激活细胞周期激活因子Myc及内耳祖细胞基因Notch1能诱导成年耳蜗感觉上皮细胞增殖。Myc及Notch1的瞬时表达使成年期支持细胞对转录因子Atoh1产生反应，并有效地转分化为毛细胞样细胞。这项研究为成年耳聋患者的治疗带来了新的希望。 耳聋会发生在人类生命周期的各个阶段 ，环境因素和遗传因素在致病上都扮有重要角色。在先天性耳聋中，一般认为60%的患者与遗传因素有关，我国每年新生约3万聋儿；在遗传性耳聋中，隐性遗传占主要比例，约80%，显性遗传约占20%。针对遗传性耳聋，目前临床上主要通过助听器、人工耳蜗等手段改善患者的听力，这些人工假体的发明为耳聋患者感知外界世界发挥了巨大的贡献，然而仍远远无法满足耳聋患者对防治药物的需求。首先，助听器和人工耳蜗目前尚无法使患者恢复自然声；其次，仅适用于部分患者；此外，据美国人工耳蜗联盟报道只有5%的患者接受人工耳蜗植入，说明仍有诸多因素的限制，现有的耳聋防治策略还远远未能满足患者的需求。 基于基因编辑技术的基因治疗在遗传疾病治疗上的应用前景毋庸置疑，近几年国内外基因编辑疗法的临床试验如火如荼，针对遗传性失明、肝脏疾病和心脏疾病的CRISPR疗法或碱基编辑疗法已经开展了临床试验。 这些成功案例也为遗传性耳聋的治疗指明了方向。
最后，舒易来主任表示， 基因治疗体系主要分为两部分，其一是递送载体，其二是其递送的治疗策略，前者需要实现特异性、高效的靶向，例如 GJB2 基因在很多细胞中都有表达，如何实现载体对多种细胞都靶向是比较困难的地方，其中筛选特异性启动子是解决方案之一，在这方面我们也已经取得了一些成果；至于治疗策略，在载体可行的前提下，依据致病机制，治疗策略的选择和优化上可以有更多的选择和尝试，然而在这么多致聋基因中，致病机制的研究远远不足。此外，体内基因编辑效率不足也是限制因素。团队正在从两方面着手，其一，提升载体的递送效率，其二，提升基因编辑效率，这将有利于促进耳聋基因治疗体系的开发和优化。目前，团队也正在积极推动耳聋基因治疗走向临床转化，也希望未来在学术界和产业界的合作下，基因治疗药物的研发和生产上能够降低成本，尽可能地开发出更多惠及耳聋患者的基因治疗药物，帮助广大耳聋患者重返有声世界。

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来团队长期致力于感音神经性聋的前沿科学创新性探索和临床转化，近年来，相关研究成果发表于 Nature Biotechnology、Science Translational Medicine、Neuron、Cell Research、Molecular Therapy、Genome Biology、Signal Transduction and Targeted Therapy、Nature Communications、Human Gene Therapy、Hearing Research 等国际著名杂志。

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文