快报 | 实验室检验流程的改变可显著提高非结核分枝杆菌的临床分离率

作者：陈素婷，王芬，薛毅，霍凤敏，贾俊楠，董玲玲，赵立平，姜广路，黄海荣

第一作者及单位：陈素婷和王芬，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病临床实验室；

通信作者及单位：黄海荣和姜广路，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病临床实验室

Doubled Nontuberculous Mycobacteria Isolation as a Consequence of Changes in the Diagnosis Algorithm

Chen S, Wang F, Xue Y, Huo F, Jia J, Dong L, Zhao L, Jiang G, Huang H.

Infect Drug Resist,  2022, 15:3347-3355.

doi: 10.2147/IDR.S368671.

PMID: 35782527. 

研究背景

非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria, NTM）在环境中广泛存在，目前已报告了200多种NTM菌种或亚种。尽管绝大多数NTM是非致病性的，但有大约60种NTM可分离自临床患者中。近年来，随着人们对NTM及其相关疾病认识的提高、分子诊断技术的发展、人类寿命的延长，以及免疫功能低下人群数量的增加等，NTM感染也呈现上升趋势。在许多发达国家，NTM病的发病率甚至超过了由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,  MTB）感染导致的结核病（TB）。与MTB一样，NTM也最常侵犯肺部，由于两者感染临床症状非常相似，病理学和影像学特征也几乎一样，临床上NTM感染很容易被误诊为TB。据报道，大约30%的疑似耐药TB患者实际上可能是NTM感染，表明NTM感染率可能要高于报告的比例。

2010年以前，国内主要采用传统的Lowenstein-Jensen（L-J）固体培养法进行分枝杆菌培养分离。同时，对硝基苯甲酸（PNB）鉴别培养基是结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）和NTM鉴别的主要方法。2010年以后，MGIT 960液体培养法逐渐开始替代L-J固体培养法。与此同时，另一种NTM初步鉴定方法——MPT64抗原检测法也逐渐应用于临床。2020年7月，首都医科大学附属北京胸科医院对分枝杆菌培养和NTM鉴别的实验室检验流程进行了统一调整。调整前（流程I），对临床样本使用L-J固体培养或MGIT 960液体培养，当医生开具药物敏感性检测单后即对培养分离到的菌株进行药物敏感性测定（DST，包含了PNB鉴别培养）；但在调整后（流程II），则先采用MGIT 960培养法进行分枝杆菌培养，再对阳性培养物进行MPT64抗原检测。基于此，本研究旨通过比较这两种检验流程中的NTM分离率和菌种组成，探讨实验室检验流程的改变对NTM肺病诊断的影响。

研究方法

1. 数据收集：采用回顾性分析方法，选取实验室检验流程调整前后的两个时间段进行比较。2019年1—5月，从疑似肺结核（PTB）患者中采集6142份呼吸道标本，包括4664份痰液和1478份支气管肺泡灌洗液（BALF）样本，均经L-J固体和（或）MGIT 960液体培养，并使用PNB鉴别培养基进行MTBC和NTM的初步鉴别（流程I）。2021年1—5月，从疑似PTB患者中采集9815份呼吸道标本（包括7929份痰液和1886份BALF样本）进行MGIT 960液体培养，并对每份阳性培养物进行MTP64抗原检测（流程II）。

2.PNB鉴别试验：PNB鉴别培养是DST试剂盒（MicroDSTTM，珠海银科）的一部分。根据试剂盒的说明进行DST测定，将在PNB（400 µg/ml）培养基中生长的菌落报告为“NTM”，否则报告为“MTBC”。

3.MGIT 960液体培养和MPT64抗原测定：将处理后的标本接种到MGIT培养瓶中，放入MGIT 960仪器（Becton, Dickinson and Company，美国）37 °C孵育培养。对阳性培养物进行抗酸杆菌染色镜检（AFB），同时使用MPT64抗原检测试剂盒（杭州创新生物，中国）对培养上清液进行检测。将AFB和MPT64抗原检测同时阳性的样本报告为“MTBC阳性”，将AFB阳性但MPT64抗原阴性的样本报告为“AFB阳性”。

4.菌种/亚种鉴定：粗提制备阳性培养物的DNA作为后续PCR反应的模板。以粗提DNA为模板，对16S rRNA、rpoB基因和hsp65基因序列进行扩增。将扩增产物送检测公司测序，测序结果与GenBank的标准序列（美国国家生物信息中心，NCBI）进行比对。

5.统计学处理：使用SPSS 21.0软件对所有数据进行统计分析。采用卡方检验对组间分类变量的差异进行检验，当数量<5时采用Fisher精确概率法检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

研究结果

1.流程I和II中的NTM分离情况：在流程I中，从1005例患者中共分离到1619株临床菌株。在这些分离株中，1103株（68.13%）进行了DST试验，包括1000株PNB阴性（报告为“MTBC”）和 103株PNB阳性（报告为“NTM”）（图1A）。103株NTM菌株均进行了菌种鉴定，96株被鉴定为NTM，7株被鉴定为其他细菌。因此，流程I中的NTM样本分离率为8.7%（96/1103）。在流程II中，来自1258例患者的2161份标本经MGIT 960培养呈阳性。其中，487例患者接受了两份或更多样本的检测。对所有阳性培养物进行MPT64抗原检测。如图1B所示，在2161份培养阳性标本中，1762份（81.54%）有MPT64 抗原阳性结果（报告为“MTBC”），而其余399份（18.46%）分离株为MPT64抗原阴性（报告为“AFB阳性”）。在399株AFB阳性分离株中，246株进行了菌种鉴定，228株被鉴定为NTM。因此，NTM样本分离率为17.11% [399×（228/246）/ 2161]。

图1  检验流程I（A）和流程II（B）的示意图

表1显示了两个流程中培养阳性的患者总数。在流程I中，1005例培养阳性病例中有690 例进行了药物敏感性试验，其中72例报告为“NTM”。进一步的菌种鉴定结果显示，67例被鉴定为NTM感染，5例被鉴定为其他细菌感染，故NTM的患者分离率为9.71%（67/690）。而且，只有2例患者的不同标本的结果不一致，其中1例患者的第一次送检样本被鉴定为诺卡菌，第二次送检标本被鉴定为MTBC；另1例患者有3份阳性培养物，其中2份被鉴定为副瘰疬分枝杆菌，1份被鉴定为胞内分枝杆菌。

在流程II中，有1014例患者的MPT64抗原为阳性（报告为“MTBC”），而244例患者的MPT64抗原为阴性但AFB为阳性（报告为“AFB 阳性”）。244例AFB阳性患者中，162例进行了菌种鉴定，151例为NTM、8例MTBC、3例为其他细菌。NTM感染患者数占AFB阳性患者数的93.21%（151/162）。因此，流程II中NTM的患者分离率为18.08% [(244×93.21%)/ 1258]。流程II中的NTM患者分离率明显高于流程I（18.08% vs 9.71%，P<0.001）。20例患者有多次标本送检且同时存在“MTBC阳性”和“AFB阳性”的报告结果，但其中有10例患者未进一步行菌种鉴定。在有菌种鉴定结果的10例患者（均为“AFB 阳性”分离株）中，6例被鉴定为NTM，而其他4例为MTBC。此外，还有4例AFB阳性病例，2次或以上送检样本的菌种鉴定结果不一致。

2. 流程I和II中NTM分离株的菌种/亚种组成：在流程I中，来自72例PNB阳性患者中的103株分离株被进一步鉴定到种/亚种水平。其中，67例患者的96株分离株被鉴定为NTM，5例患者的7株分离株被报告为其他抗酸菌。在67例患者中共鉴定到10种不同的NTM种/亚种（图2A）。4种最常见的临床NTM菌种分别是胞内分枝杆菌（40株，59.7%）、脓肿分枝杆菌（12株，17.91%）、堪萨斯分枝杆菌（6株，8.96%）、鸟分枝杆菌（3株，4.48%），其他不常见的NTM有6种（表1）。在流程II中，有140株NTM分离株鉴定到种/亚种水平。共鉴定到16种NTM 菌种/亚种（图2B）。常见分离的NTM菌种依次是胞内分枝杆菌（64株， 45.71%）、脓肿分枝杆菌（28株，20%）、鸟分枝杆菌（17株，12.14%）、副戈登分枝杆菌（8株，5.71%）、偶然分枝杆菌（4株，2.86%）、戈登分枝杆菌（4株，2.86%）、龟分枝杆菌（4株，2.86%）、堪萨斯分枝杆菌（3株，2.14%）。两个流程中最常分离的NTM菌种均为胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。

表1  两个流程中NTM的分离情况

注  “报告为 NTM” 指有AFB阳性结果的分离株；流程I中指L-J/MGIT 960结合PNB差异生长试验检测结果；流程 II中指MGI T960 结合MPT64 抗原试验检测结果。M.intracellulare为胞内分枝杆菌，M.abscessus为脓肿分枝杆菌，M.kansasii为堪萨斯分枝杆菌，M.avium为鸟分枝杆菌，M. parorden为副戈登分枝杆菌

图2  流程I（A）和流程II（B）中NTM的菌种组成情况

3. 在BALF中鉴定出NTM：流程I从BALF中共鉴定出3例NTM感染患者，包括胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌各1例。流程II从BALF中共鉴定到17例NTM感染患者，包括7例胞内分枝杆菌、6例鸟分枝杆菌、3例脓肿分枝杆菌和1例堪萨斯分枝杆菌。在流程I和II中，在BALF标本中鉴定的NTM种类明显少于痰液标本（分别为3例 vs.10例和4 例vs.16例），但从BALF中鉴定到的NTM菌种均是临床上较常见的NTM菌种。

4. 两个流程中NTM鉴定的一致性：在流程I中，68例进行了NTM鉴定，其中19例至少两次痰液被确认为NTM，而只有1例在两次标本鉴定结果不一致。因此，流程I中NTM鉴别的一致性为94.74%（18/19）。相比之下，在流程II中，144例患者被鉴定为NTM感染，其中39例多次送检标本具有一致的鉴定结果，而4例多次送检标本的鉴定结果不一致。因此，NTM鉴定与流程II的一致性为90.7%（39/43）。然而，两个流程在NTM鉴定一致性上并没有显著差异（P>0.05）。

5. 三年间NTM鉴定率比较：为分析检验流程的改变与NTM分离率提高的相关性，研究者进一步对我院2019—2021年的菌种鉴定结果进行了初步分析。如图3所示，NTM分离株在送检鉴定的分枝杆菌中的比例逐年增加，即从2019年的58.18%（498/856）增加到2021年的72.93%（617/846）。值得注意的是，与2020年上半年相比，下半年的NTM鉴定率有明显增加[68.87%(261/379) vs.56.7%(110/194)]。

图3  2019—2021年首都医科大学附属北京胸科医院菌种鉴定项目中NTM占比

研究结论

在检验流程改变前，NTM感染可能远被低估。MGIT 960培养和MPT64抗原检测相结合的检验流程可以及时、简便地鉴别NTM临床分离株，提高NTM感染的诊断水平。 

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：陈素婷

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-07-22

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