潘世扬教授谈一种新型带内标的双重实时PCR法用于精确定量血浆DNA

循环DNA水平在许多病理情况下升高。然而，大量实验室在循环DNA定量分析上存在的显著差异，已成为相当大的隐患，阻碍其临床应用。江苏省人民医院检验学部主任潘世扬教授等设计了一种新型重组DNA片段，可用作新开发和经过确认的双重实时PCR检测的内标。2019年第一期的《临床实验室》杂志刊登了潘世扬教授相关的文章，下面金宝就与诸位一起学习一下，希望给诸位检验同道带来启发。  

潘世扬，教授、研究员、主任医师和博士生导师。江苏省人民医院检验学部主任、南京医科大学医学检验系主任。中华医学会检验医学分会副主任委员、中国医师协会检验医师分会常务理事、江苏省医学会检验分会前主任委员和《中华检验医学杂志》编委，是《BMC Cancer》等SCI期刊审稿专家。

这个新兴领域引起人们广泛的兴趣，关于其对各种疾病的潜在临床应用的报告相继发表，比如恶性肿瘤、产前疾病、创伤、器官功能不全、自身免疫疾病和器官移植。然而，大量实验室在循环DNA定量分析上存在的显著差异，已成为相当大的隐患，阻碍其在临床实验室的应用。2004年，一项大型前瞻性研究使用PicoGreen双链DNA定量试剂盒（Invitrogen, Waltham, MA, USA）测定健康受试者和癌症患者的血浆DNA浓度，该法设置参考标准曲线。结果显示20个参与实验室测定的健康对照受试者的血浆DNA水平存在显著差异，这种差异主要来源于DNA提取过程。近年来，相继制定了多种DNA提取方案。然而，提取过程中循环DNA不可避免的各种丢失可能对结果产生重大影响。

为了解决这一问题，血浆DNA定量的临床应用需要不确定度较低的精确检测方法。为此，潘世扬教授等建立了“带内参照的人血浆DNA定量检测技术”，通过双重实时荧光定量PCR检测方法，对血浆DNA进行定量测定。简而言之，从人看家β-actin基因中选取相应41bp序列与质粒载体重组。经过核酸内切酶酶切后，将已知浓度的线性重组质粒DNA作为内标加入到血浆样本中并与内源性核酸一起提取出来。使用常见的反向引物通过双重实时PCR在同一反应管中同时扩增内标和目的基因（β-actin），使扩增效率相近。

扩增完成后，根据已知内标数量计算目的基因的浓度。潘世扬教授指出，这种新型检测与两种传统方法相比，检测限更低为0.1ng/mL，批内和批间CV更小，而且回收试验的准确度更高。健康男性的血浆DNA中位值（20.3ng/mL，n=3,092）显著高于健康女性（16.1ng/mL，n=2,350）（Mann-Whitney两独立样本秩和检验，P <0.0001）。血浆DNA浓度的参考区间分别是健康女性0-45.8ng/mL和健康男性0-52.5ng/mL。大多数创伤患者（96%）的血浆DNA浓度高于正常临界值上限，与相应的损伤严重程度评分密切相关（R2 =0.916，P <0.0001）。       

潘世扬教授认为，新开发的血浆DNA定量方法，能够消除血浆样本处理期间发生的系统误差，表现出稳定的分析性能和可接受的重复性、精密度和准确度。因此，这种方法在血浆DNA定量的多中心研究以及临床用于诊断和监测某些疾病上具有非常广阔的前景。

原文发布时间 | 2019年2月18日