Nature | 何垚/宋贺等解析端粒DNA延长关键复合物的冷冻电镜结构

端粒是位于真核细胞线性染色体末端由重复DNA序列及保护蛋白构成的复合物。端粒的存在解决了线性染色体的“末端复制问题”，对于保持真核细胞基因组的稳定性和完整性具有重要作用。在成体细胞中，端粒DNA的长度会随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，最终引发细胞衰老和死亡。

而在胚胎干细胞和癌细胞中，缩短的端粒DNA被延长，从而保持细胞的“永生”。因此，自端粒发现以来，其功能和延长机制一直是细胞衰老、干细胞和癌症研究的热点。

端粒DNA包含一条富含鸟嘌呤重复序列的G链 (人的序列为TTAGGG) 和与之互补配对的C链。这两条链的延长需要四个关键复合物的参与协同进行：

(1) 位于端粒末端的shelterin复合物首先通过TPP1蛋白直接招募端粒酶 (telomerase)；

(2) 端粒酶利用自身携带的RNA模板连续合成数十个重复序列，对G链进行延伸；

(3) 随后shelterin招募由CTC1–STN1–TEN1构成的CST复合物终止G链的合成；

(4) 最终CST招募DNA聚合酶α–引物酶复合物 (DNA polymerase α–primase, PolαPrim)，利用新合成的G链作为模板，合成与之互补配对的C链。

近两年随着样品制备和冷冻电镜技术的进步，Juli Feigon及其他几个研究组先后报道了四膜虫和人源端粒酶的高分辨率结构【1-5】。这些结构揭示了端粒酶被TPP1招募，以及端粒酶连续合成G链重复序列的结构机制。然而人们对于随后CST招募PolαPrim进行C链合成的理解仍然受限于相关复合物结构的缺失。

2022年7月13日，加州大学洛杉矶分校 (UCLA) 的Juli Feigon组和周正洪组合作 (何垚博士和宋贺博士为共同第一作者) 于Nature在线发表了题为Structure of Tetrahymena telomerase-bound CST with polymerase α-primase的最新研究成果。该文章报道了结合在四膜虫端粒酶上的CST在结合PolαPrim前后的冷冻电镜结构，为理解端粒DNA G链和C链协同合成的分子机理提供了关键的结构基础。

与哺乳动物的CST不同，四膜虫的CST通过p50 (TPP1在四膜虫中的同源蛋白) 连接在端粒酶核心上，三者共同参与构成了四膜虫端粒酶复合物。在此研究中，作者将原位纯化的四膜虫端粒酶和重组表达纯化的四膜虫PolαPrim混合，在体外组装出包含端粒酶核心、p50 (TPP1)、CST和PolαPrim这四个端粒DNA延长关键组分的“超级”复合物。

接下来的功能实验证明该复合物可以通过端粒酶核心延长G链，并利用新合成的G链作为模板通过PolαPrim合成互补的C链。针对该复合物及其组分的单颗粒重构解析了端粒酶 (2.9 Å)、端粒酶–CST (3.5 Å)、CST–PolαPrim (4.2 Å) 及PolαPrim (4.0-4.3 Å) 等一系列冷冻电镜结构，进而揭示了这些关键组分之间相互作用的结构机制。

图一 四膜虫端粒酶 (左)、端粒酶–CST (中) 以及端粒酶–CST–PolαPrim (右) 的冷冻电镜结构。

 这些结构显示，四膜虫CST中的Ctc1亚基包含三个OB结构域，其中位于N端的OB结构域通过与p50相互作用将CST锚链到端粒酶上。CST的另外一侧与PolαPrim中的DNA聚合酶亚基POLA1相互作用，形成了一个孔道，连通了结合在CST上的G链模板和位于POLA1上的合成C链的活性中心。在结构解析的过程中，作者发现CST相对于p50的位置并不固定，而是处于连续变化的过程中。通过结合冷冻电镜和核磁共振方法各自的优势，作者展示了CST与p50完整的相互作用界面，揭示了两者柔性连接的结构基础。  

图二CST结构及其与p50的相互作用界面。 

与该文章同时发表在Nature上的还有两篇针对人源CST–PolαPrim的结构 【6】 和功能 【7】 研究。连同稍早些时候报道的人源CST–PolαPrim处于招募阶段的结构 【8】 ，这些结构互相印证、互相补充，为充分理解端粒DNA延长的分子机制提供了坚实的结构基础。 

参考文献

  1. He, Y., Wang, Y., Liu, B., Helmling, C., Susac, L., Cheng, R., Zhou, Z.H., and Feigon, J. (2021). Structures of telomerase at several steps of telomere repeat synthesis. Nature 593, 454-459. 2. Ghanim, G.E., Fountain, A.J., van Roon, A.M., Rangan, R., Das, R., Collins, K., and Nguyen, T.H.D. (2021). Structure of human telomerase holoenzyme with bound telomeric DNA. Nature  593, 449-453. 3. Wan, F., Ding, Y., Zhang, Y., Wu, Z., Li, S., Yang, L., Yan, X., Lan, P., Li, G., Wu, J., and Lei, M. (2021). Zipper head mechanism of telomere synthesis by human telomerase. Cell Res 31, 1275-1290. 4. Liu, B., He, Y., Wang, Y., Song, H., Zhou, Z.H., and Feigon, J. (2022). Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature  604, 578-583. 5. Sekne, Z., Ghanim, G.E., van Roon, A.M., and Nguyen, T.H.D. (2022). Structural basis of human telomerase recruitment by TPP1-POT1. Science  375, 1173-1176. 6. He, Q., Lin, X., Chavez, B.L., Agrawal, S., Lusk, B.L., and Lim, C.J. (2022). Structures of the human CST-Polα–primase complex bound to telomere templates. Nature . 7. Zaug, A.J., Goodrich, K.J., Song, J.J., Sullivan, A.E., and Cech, T.R. (2022). Reconstitution of a telomeric replicon organized by CST. Nature . 8. Cai, S.W., Zinder, J.C., Svetlov, V., Bush, M.W., Nudler, E., Walz, T., and de Lange, T. (2022). Cryo-EM structure of the human CST-Polalpha/primase complex in a recruitment state. Nat Struct Mol Biol.

责编 | 兮

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