阐明化疗后结直肠癌干细胞复发的机制-根治性治疗方法的发展

藤井正幸专任讲师太田由纪和庆应义塾大学医学院坂口光弘纪念课程（类器官医学）佐藤敏郎教授的研究小组发现，控制大肠癌生长的人类“癌症干细胞”是化疗后，研究人员第一次阐明了导致癌细胞复发而不死的机制。一直认为即使化疗也不会死亡的“癌症干细胞”的存在是癌症复发的原因，但细节尚未阐明。这一次，研究小组成功开发了一种将人类大肠癌移植到小鼠体内并实时观察其行为的技术。这项技术揭示了一些“癌症干细胞”处于休眠状态（不增殖）并且在化学疗法中存活并克隆增殖。此外，研究人员发现“癌症干细胞”通过附着在细胞外基质（基底膜）上而保持休眠状态。研究人员还发现，当与基底膜的粘附减弱时，休眠的癌症干细胞会随着 YAP 信号的激活而恢复增殖。因此，研究小组在动物模型中证实，抑制YAP信号的药物可抑制化疗后癌症干细胞的再生长，延缓癌症的复发。这一成果有望引领一种新的治疗方法的发展，重点关注癌症的复发，这决定了结直肠癌的生命预后。

研究背景及概要

日本患大肠癌的人数是所有癌症中最高的，2020年的死亡人数在女性中最高，在男性中排名第三，化学疗法的最新进展改善了不可切除的晚期癌症的治疗结果。然而，一些癌细胞在化疗后存活，导致复发，因此结直肠癌的死亡人数居高不下。因此，了解癌症复发的机制并开发有效的治疗方法是一项紧迫的任务，但由于技术问题而难以实现。在之前的研究中，佐藤教授等人开发了体外增殖人结肠上皮细胞的“类器官技术”。然后，通过使用这项技术将人类结肠直肠癌类器官移植到小鼠体内，研究人员成功地创造了模仿体内结肠直肠癌的癌组织。其结果是，研究迄今为止无法观察到的癌细胞的行为成为可能。表明存在“癌症干细胞”（Shimokawa Ohta et al. Nature 2017）。研究小组将采集自患者的结肠癌细胞作为类器官进行培养，发现表达一种名为LGR5的分子的结肠癌细胞（以下简称LGR5癌细胞）是癌症干细胞。该分析描述了标记的 LGR5 癌细胞如何产生荧光发光的癌组织。另一方面，不是LGR5癌细胞的癌细胞没有出现新的癌组织。癌症干细胞是癌症复发原因的最有希望的候选者，但即使采用上述技术，研究人员也未能找到线索。原因之一是结直肠癌类器官被植入小鼠皮下，因此无法观察到单个癌细胞。这项研究表明，这一瓶颈已被克服，一些结直肠癌干细胞处于休眠状态，导致化疗耐药和癌症复发。此外，研究人员阐明了结直肠癌干细胞如何保持休眠状态并导致癌症复发的分子机制。

2) 研究概要 实时成像揭示“癌症干细胞”的动态行为 研究小组去除覆盖移植类器官的小鼠皮肤并更换它们，以便在细胞水平上可视化癌症干细胞的动态。嵌入一个透明窗口。通过这个窗口，现在可以实时观察每个 LGR5 癌细胞如何产生发光的肿瘤（图 1）。这种“实时成像”证实了 LGR5 癌细胞的行为存在三种模式。大约 24% 的 LGR5 癌细胞会形成持续生长的大肿瘤，而大约 54% 会在此过程中失去癌细胞并且无法产生新的肿瘤。这是因为细胞相互竞争，胜者产生新的肿瘤，败者消失。有趣的是，其余 21% 的 LGR5 癌细胞在观察期间处于休眠状态，几乎没有分裂。

图 1：LGR5 癌细胞的增殖（实时成像）

（上）将癌症类器官移植到小鼠身上的塑料窗下，LGR5 癌细胞在显微镜下仍然存活形成肿瘤，从而可以观察到。 （下）一个LGR5癌细胞一个接一个地产生子代细胞（红色），拍摄28天看到形成一个新的肿瘤。

图 2：化疗耐受性和复发过程的实时成像（左上）概念图。

休眠的 LGR5 癌细胞用蓝色标记，休眠状态（绿色）用 LGR5 癌细胞（红色）和休眠状态（绿色）观察到存活。休眠的 LGR5 癌细胞和其他休眠的癌细胞（绿色）在化疗中存活下来，然后在休眠的 LGR5 癌细胞中存活下来，从休眠中醒来，子代细胞（蓝色）产生并重塑了肿瘤。

（右上）休眠的 LGR5 癌细胞在化疗后比增殖的 LGR5 癌细胞更有可能存活。 p = 7.8 x 10–8，Fisher 精确检验。（底部）实际观察图像。随后的休眠 LGR5 癌细胞及其子代细胞（蓝色）由虚线白线显示。研究人员捕捉到了休眠的 LGR5 癌细胞在化疗后如何存活并重塑。比例尺：100 μm。

控制人体结肠“癌干细胞”休眠状态的胶原蛋白

此外，人体结肠休眠 LGR5 研究人员正在研究癌细胞作为“癌干细胞”COL17A1 维持自身细胞周期的机制。发现涉及一种称为COL17A1的胶原蛋白。 COL17A1 将结直肠癌细胞牢固地锚定在其下方的基底膜上。休眠 LGR5 癌细胞增殖 与 LGR5 癌细胞相比，COL17A1 表达增加 直接观察活癌细胞膜控制休眠状态（图 3）。接下来，为了确定 COL17A1 是否控制休眠，研究人员使用基因组编辑技术敲除结肠直肠癌类器官的 COL17A1 基因。无法表达 COL17A1 的结直肠癌中的 LGR5 癌细胞丢失了 p27 并且无法入睡，并且对类器官进行了化学疗法。此外，当 COL17A1 在 COL17A1 被敲除的结直肠癌类器官中重新表达时，休眠的 LGR5 癌细胞再次出现。结果表明，休眠的 LGR5 癌细胞与 COL17A1 一起粘附在基底膜上以维持休眠状态，并对化疗产生耐药性。 COL17A1 通过抑制 YAP 信号使细胞保持休眠 研究人员研究了 COL17A1 粘附如何使休眠的 LGR5 癌细胞保持休眠状态。结果，当 COL17A1 的粘附丧失时，信号 FAK 和 YAP 被激活，休眠的 LGR5 癌细胞从休眠中唤醒并开始增殖。另一方面，在这种情况下，用药物阻断 YAP 信号会使休眠的 LGR5 癌细胞处于休眠状态。这表明休眠的 LGR5 癌细胞通过 COL17A1 的稳定粘附抑制 FAK-YAP 信号并保持休眠状态。研究人员研究了上述 COL17A1-FAK-YAP 通路如何参与化疗后存活的癌细胞的癌症复发过程。化学疗法暴露的人类结肠直肠癌细胞类器官随后会产生一种酶，该酶会破坏胶原分子，从而破坏 COL17A1。缺乏 COL17A1 的结肠直肠癌细胞会产生休眠状态，激活 FAK-YAP 信号并唤醒和增殖休眠的 LGR5 癌细胞。因此，发现COL17A1创造了一种休眠状态，保护癌细胞免受化疗，而它很容易被化疗破坏，导致FAK-YAP信号的激活和癌细胞的再生（图3）。

图 3：癌症干细胞休眠开关的概念图

YAP靶向治疗可以延迟化疗后癌症的复发

休眠 LGR5 癌细胞通过 COL17A1（左）粘附在基底膜上，从而保持休眠状态。当这种粘附被化疗刺激破坏时，支架较差的细胞会激活 FAK-YAP 信号，从休眠中唤醒，并开始作为增殖性 LGR5 癌症干细胞增殖（右）。 YAP靶向治疗延缓化疗后癌症复发 到目前为止，有人认为化疗后残留的休眠LGR5癌细胞会激活YAP信号并为再次增殖做准备，因此研究小组使用动物模型验证了这一假设。对移植了结肠直肠类器官的小鼠进行化疗，然后是基因减弱的 YAP 信号，这显着延迟了化疗后的癌症复发（图 4）。此外，针对 YAP 靶向治疗的临床应用，研究人员尝试用药物（小分子 TEAD 抑制剂；TEADi）抑制 YAP 信号。结果，TEADi 单药治疗仅显示出微弱的肿瘤抑制作用，但化疗后给予 TEADi（伊立替康）显着抑制了化疗后的肿瘤再生（图 4）。综上所述，抑制YAP信号的药物具有预防大肠癌化疗后复发的新治疗作用，有望带来癌症治疗的突破。

 图 4：以 FAK-YAP 信号抑制为重点的癌症复发预防模型 该图显示了在小鼠皮下移植的人结直肠癌的大小变化。 

（左）与仅化疗组相比，化疗（伊立替康）后 YAP 信号的衰减显着降低了肿瘤复发。 （右）化学治疗后施用了一种能够减弱 YAP 信号的药物（TEADi）。化疗后给予 TEADi 显着抑制肿瘤重塑。 p <0.05，重复测量的混合效应模型。

研究成果和意义/未来发展

在这项研究中，研究团队整合了体内成像、细胞谱系分析和源自患者的结直肠癌类器官，以表明休眠的 LGR5 癌细胞与化疗耐药和复发有关。研究团队还发现胶原蛋白COL17A1通过调节休眠LGR5癌细胞的YAP信号来调节休眠和增殖状态。基于这些结果，研究小组通过人类结直肠癌类器官的移植模型证明了下一代 YAP 信号抑制剂 (TEADi) 可以预防癌症复发。 预计该结果将在未来应用于临床，成为预防化疗后癌症和复发的新治疗方法。

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