学术先声丨NOTCH1突变降低T1-2N0期可切除喉癌患者的免疫应答，导致术后复发风险增高

喉癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤, 主要发生在声门上或声门区域，据国内统计占耳鼻咽喉部位恶性肿瘤的7.9%-35%, 排头颈部恶性肿瘤的第三位。早期喉癌（T1-2N0）首选的治疗方式为手术，其治愈率接近90%。然而，T1期声门型喉癌的术后局部复发率为5-10%，早期声门上型喉癌的复发率可接近10-20%。因此，阐明喉癌复发机制的基因组和免疫学特征，为早期高危喉癌患者提供更精准的干预策略，具有重要临床意义。

近日，江苏省人民医院耳鼻喉科与先声诊断医学团队合作，基于SimcereDx  Onco500的DNA测序，分析了T1-2N0喉癌患者术后复发组和未复发组间基因组特征差异。同时，使用NanoString-RNA免疫微环境panel探索了NOTCH1突变的复发患者与NOTCH1野生型复发患者之间的肿瘤免疫微环境（TiME）差异，详细阐述了NOTCH1突变与复发肿瘤TiME的特征。本研究揭示了复发喉癌免疫逃逸的新见解，有助于改善喉癌复发患者的个性化精准管理，文章近期发表在免疫学主流期刊Frontiers in Immunology 杂志（IF=8.786）[1]。

研究流程

  从2017年1月到2020年1月，回顾性收集52名被确诊为T1-2N0原发性喉癌的标本。所有患者都接受了手术切除术，且没有接受新辅助、辅助化疗或其他全身治疗。基于前期研究文献，共303名T1声门型喉癌患者中，38名复发患者从确诊到局部复发的中位时间为20个月，同时由于T1期声门上型喉癌的患者术后局部复发率略高于声门型喉癌患者。因此本研究选择了24个月作为可切除T1-2N0喉癌患者的复发阈值。在术后随访期间，24个月内局部或远处复发的患者被归为复发组（n=23），手术后2年以上没有局部复发的患者被归为未复发组（n=19）。研究流程图如图1所示。    

图1.研究流程图

研究结果

1. 患者基线特征

研究分析了42名患者（37名男性和5名女性）基线特征。患者中位年龄为67岁。T1期患者比例为83%（35/42）。除TMB值外，两组在性别、年龄、吸烟史、饮酒史、临床分期等方面没有显著差异。患者的基线特征见图2。  

图2. 患者基线特征

2. 患者基因组突变谱特征

研究使用包括523个癌症相关基因的Onco500产品对42名喉癌患者进行了基因检测。图3A显示，所以患者基因突变次数位于2-31之间，中位基因突变数为7个，复发组基因平均突变数高于未复发组（9.0与6.0，p=0.045）。图3B描述了每位患者的基因突变特征，在211个癌症相关基因中共检测到469不同类型的基因突变，图中展示了51个基因的突变特征。超过5位患者（>10%）检测到的突变基因包括TP53（78.5%）、FAT1（26%）、LRP1B（19%）、CDKN2A（17%）、TET2（17%）、NOTCH1（12%）和NRG1（12%），且所有样本都是微卫星稳定状态（MSS）。  

图3. 队列中喉癌患者基因突变特征分析

在这些突变基因中，DNA损伤修复相关基因TP53，在队列中突变频率最高，该基因最常见的突变类型是错义突变。复发组患者往往有更高的TP53突变率（87% vs 68%）。基因共存和互斥性分析表明，FAT1/CDKN2A和FAT1/SMAD4显著共存，FAT1与LRP1B互斥（图3A）。编码内分泌LDL家族受体的LRP1B是人类癌症十大显著突变基因之一。LRP1B突变与黑色素瘤和NSCLC患者更高的TMB和更好的生存获益相关。本研究中LRP1B基因唯一突变类型是错义突变，LRP1B突变往往与GNAS、KEAP1、KMT2D、RANBP2和SOX17基因突变共存（图4A）。同时，研究中共检测到五种主要突变类型：273种错义突变（58.2%）、110种拷贝数变异（23.4%）、43种移码突变（9.2%）、35种无义突变（7.5%）和8种其他类型突变（1.7%）。研究显示，复发组与未复发组之间不同突变类型比例没有显著差异（图4B）。

图4. 基因共存与互斥性分析以及组间不同基因突变类型占比

3. TMB-H和NOTCH1突变与较短RFS相关

TMB被认为与肿瘤新抗原数量相关，并具有预测免疫治疗疗效的作用。TMB-H已被证实是可切除NSCLC患者复发的不良预后因素。本研究探索了TMB-H是否与喉癌队列较短RFS相关。结果显示，喉癌复发组TMB值高于未复发组（7.03与4.69，图5A），表明复发组有更多的体细胞突变，与可切除NSCLC的研究结果一致，即可切除喉癌队列的TMB（前25%）较高与患者较短RFS结果相关（图5B）。研究进一步研究了该队列中存在多个体细胞突变（>1突变）和只有一个体细胞突变的患者的临床获益情况。与TMB-H结果一致，具有多个体细胞基因突变（n=37）的患者RFS比只有一个体细胞基因突变的患者（n=5）更低。以上结果表明，以大量体细胞基因突变为特征的TMB-H可能与喉癌患者的肿瘤恶性程度相关，导致喉癌患者较早复发。 研究进一步探讨了复发组与未复发组两组之间单个体细胞基因突变的比率。在所有候选基因中，LRP1B（30.4% vs. 5.3%，图5C）和NOTCH1（21.7% vs. 0%，图5C）在复发组中突变频率显著更高，同时所有NOTCH1突变都发生在复发组中。K-M生存曲线表明，LRP1B突变与无复发生存率（RFS）、总体生存率（OS）不相关（图5D、5E）。本研究喉癌队列中，NOTCH1突变患者的RFS和OS显著缩短（图5F、5G）。同时，TCGA喉癌数据库结果证实，不同分期肿瘤（主要是晚期）的NOTCH1突变患者PFI、DSS和OS显著缩短（图5I-K）。这些结果表明，NOTCH1突变是可切除喉癌患者的一个不良预后因素，携带NOTCH1突变的喉癌患者复发风险更高。

图5. TMB和单个基因突变与临床生存获益相关

（A）复发组和未复发组中的TMB值。（B）更高的TMB（排名25%）与较差RFS相关。（C）复发组和未复发组间体细胞基因突变的比率。（D）LRP1B突变与RFS的K-M生存曲线。（E）LRP1B突变与OS的K-M生存曲线。（F）NOTCH1突变与RFS的K-M生存曲线。（G）NOTCH1突变与OS的K-M生存曲线。（H）NOTCH1突变组和野生型组中的TMB值。（I）TCGA中NOTCH1突变与PFI的K-M生存曲线。（J）TCGA中NOTCH1突变与DSS的K-M生存曲线。（K）TCGA中NOTCH1突变与OS的K-M生存曲线。

4. NOTCH1突变在疾病复发和生存获益中的独立预后作用

临床和基因突变特征是患者的潜在预测因素。因此，本研究使用单/多因素Cox回归模型分析了基因突变、基线临床特征，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、临床分期等与患者RFS和OS之间的相关性。单变量分析结果表明，NOTCH1和TMB-H是RFS的不良预后因素（图6）。为了确定NOTCH1和TMB-H是否是生存获益的独立预测因素，单变量分析中p<0.05的变量被纳入多因素分析。多因素分析结果表明，NOTCH1和TMB-H都是与较短RFS显著相关的独立预测因素（图6）。此外，单因素和多因素分析显示，只有NOTCH1突变被确定为OS的独立预后因素。

图6. NOTCH1突变与RFS的单因素和多因素分析结果

5. 基于NOTCH1突变的差异表达基因 （DEG）鉴定

之前的研究表明，IA期NSCLC复发患者免疫活性较弱。因此，为了阐明NOTCH1突变在可切除喉癌复发中的作用，研究通过Nano-String基因表达分析平台研究了NOTCH1突变和NOTCH1野生型复发喉癌患者的TiME抗肿瘤免疫活性。排除了RNA降解或质控不合格标本后，分析了4名NOTCH1突变复发患者和17名NOTCH1野生型复发患者的肿瘤样本。研究首先探讨了两组之间的DEG，NOTCH1突变组中有七个DEG上调（图7A，B），这些基因大多与特定的生长刺激因子相关，如MYC、ADM、TGFβ1和TAP1。此外，CD44是一种参与细胞互作、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白基因，在NOTCH1突变患者中表达更高。NOTCH1突变患者TNFSF10和PSMB9的表达也更高。这些上调基因有可能成为NOTCH1突变喉癌复发患者精准治疗的小分子靶点。 接下来，研究分析了表达差异基因的各免疫细胞群的丰富度。研究对14种免疫细胞进行了评估，与NOTCH1野生型相比，NOTCH1突变组中一些免疫细胞亚群评分显著减少（图5C，D），如B细胞、CD45 + 细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和T细胞，这表明NOTCH1突变复发患者的免疫应答减弱。

图7. 基于NOTCH1突变和免疫细胞特征的DEG分析

此外，我们通过GO和KEGG分析探讨了DEGs的功能，发现GO富集的DEGs主要集中在受体和配体的激活通路上（图8A）。KEGG分析表明，DEGs集中在自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞粘附分子信号通路上（图8B）。此外，GSEA结果表明，NOTCH1突变组中细胞周期相关基因富集，表明NOTCH1突变可能与肿瘤细胞周期调控呈正相关，同时与较差的预后相关（图8C）。

图8. DEG富集分析以及NOTCH1突变复发组和野生型组中免疫评分

6. NOTCH1突变组中其他免疫特征

目前已有生物标志物被证实可以用来评估适应性免疫反应。本研究评估了肿瘤免疫微环境的差异。结果表明，相关基因的表达，如T细胞评分（CD2、CD3D、CD3E、HLA-E、IL2RG、NKG7，图9A，B），B细胞评分（CXCL13，CXCR6，IL18，IL2RG，LCK，PSMB10，TNFRSF4，TNFRRSF14，图9C，D）和免疫特征评分（CD2、CD247、CD3E、GZMH、GZMK、NKG7、PRF1，图9E，F），在NOTCH1突变复发组中显著降低。此外，进一步分析了TIL评分，该评分包含不同的免疫细胞类群（B细胞、CD8 T细胞、细胞毒性细胞、CD8细胞、巨噬细胞、NK CD56dim细胞、总T细胞），发现NOTCH1突变复发组细胞评分显著降低（图9G，H）。然而，CTL评分、CYT评分，趋化因子评分，血管生成因子评分，IFN-γ signature评分或T细胞炎症基因表达谱（GEP）评分在两组中没有显著差异。因此，这些免疫表型的减弱可能导致NOTCH1突变患者发生免疫逃逸和术后复发。

图9. NOTCH1突变组中改变的的免疫相关signature

7. TCGA喉癌数据库数据发现NOTCH1突变与免疫浸润改变相关

为了进一步确认NOTCH1突变与免疫细胞类群改变的关系，研究使用TIMER算法评估TCGA数据库中喉癌数据集中的免疫细胞浸润状态。与NanoString基因表达分析结果一致，NOTCH1突变组中激活的B细胞的比例显著低于野生型组（图10A）。为了进一步探索喉癌NOTCH1突变与适应性免疫应答的相关机制，GSEA分析发现：NOTCH1的突变与免疫反应通路激活、适应性免疫反应通路、B细胞激活通路和免疫反应激活细胞表面受体信号通路显著富集，且对应的signature功能在NOTCH1突变组（图10B）中均下调，这也进一步提示NOTCH1突变致使适应性免疫反应的减弱。此外，细胞粘附通路基因表达水平在NOTCH1突变组（图10B）中也受到下调，提示这些患者的细胞间粘附功能受损。综上，患者机体的肿瘤免疫特点是决定复发的关键因素，肿瘤微环境中的适应性免疫反应减弱和粘附功能受损可能会导致复发的关键原因。

图10. TCGA分析显示NOTCH1突变与免疫浸润及差异化的通路相关

讨论

本研究首次确定了喉癌复发的不同分子机制和复发患者的免疫学特征。结果表明，由于免疫应答减弱，NOTCH1突变与较短的无复发生存期相关。这一发现与越来越多的研究结果一致，即宿主免疫应答在肿瘤发生和进展中起着关键的作用。该研究可能有助于进一步阐明早期喉癌患者术后复发机制，从而帮助潜在高危患者制定潜在的治疗策略。显然，这些发现还需在未来的前瞻性试验中加以验证。

参考文献： [1]  Gong X, Chen H, Zhang L, et al. NOTCH1 Mutation Impairs the Adaptive Immune Response, Leading to Decreased Relapse-Free Survival In Patients with Resected T1-2N0 Laryngeal Cancer[J]. 

撰写丨YDX 编辑、排版丨SX