ADC另类毒素α-鹅膏蕈碱浅析

前言

大概今年二月份时候，华东医药通过投资入股拿到了德国Heidelberg Pharma大概35%的股权，成为其第二大股东。Heidelberg把自己的ADC平台取了个炫酷的名字叫做ATAC(Antibody Targeted Amanitin Conjugates)。

说到底就是使用一个相对来说比较少见的α-amanitin作为payload，采用thiomab技术对抗体做工程化改造，在265号位点定点突变半胱氨酸后通过马来酰亚胺连接一个相对最传统的Val-Cit linker来说更加亲水的Val-Ala linker组装成dar2的ADC。技术都是通用的技术，那么作为被平台技术着重强调的α-amanitin到底有什么特别之处，我们可以通过一些文献简单的调查一下。

α-amanitin的MOA与TP53突变   目前比较常见的ADC payload主要作用靶标可以分成两种，分别作用于微管蛋白与DNA。作用与微管蛋白的主要有海兔毒素衍生物（MMAE、MMAF等），美登素类（DM1、DM4等）以及微管溶素（Tubulysins）；作用于DNA的有针对DNA小沟的PBD与杜卡霉素，还有就是当下最火的拓扑异构酶I抑制剂—喜树碱类衍生物，大冤种吉利德210亿刀乐买下的Trodelvy使用的SN38以及目前的HER2 ADC之神第一三共所使用的Dxd。   以上大多数类型的payload都是作用与细胞分裂周期或者诱导细胞复制停滞，而α-amanitin可以在nano molar浓度下高效结合真核生物的RNA聚合酶Ⅱ从而上千倍的降低转录和蛋白合成效率。因此amanitin作为毒素的ADC不仅可以杀死处于分裂阶段的肿瘤细胞，也可以杀死处于休眠阶段的细胞，包括肿瘤干细胞。此外RNA聚合酶Ⅱ是细胞代谢的一个关键通路，想绕过此通道来达成耐药的可能性非常低。而且α-amanitin基本不会被MDR1 等药物转运蛋白外排，又绕过了一个经典的ADC耐药机制。  

图1：amanitin结构

由图1可以看出，α-amanitin是一个极度亲水的分子，这个与现在常见ADC payload多为疏水分子有着根本性不同，目前通过DS8201的经验得出的结论通常是cleavable linker配合疏水性的payload的组合达成的bystander killing是ADC针对肿瘤异质性的一个独门秘技，在2021年的ADC San Diego会议上，主持人对Heidelberg Pharma的代表也做出了以上疑问，其具体回复我们下面说。   亲水的payload在缺失了bystander killing以后，也会带来一些独特的好处，首先是不会导致ADC聚集的发生，同时由于仍然是基于半胱氨酸的的偶联技术，ADC在体内时由于逆迈克尔加成所导致linker-payload丢失却由于其linker-payload，以及游离payload高度的亲水性从而无法透过普通的细胞膜也就由此无法因此带来脱靶毒性。虽然游离的α-amanitin针对普通细胞的毒性不高，但是α-amanitin是肝脏细胞上的一个OATP1B3转运蛋白底物，可以通过此途径被内吞，这也是为什么误食赭鹅膏等富含各种Amatoxins毒素的毒蘑菇会带来强烈肝毒性的原因。不过幸运的是，α-amanitin偶联后的ADC不再会被OATP1B3蛋白内吞从而带来过于强烈的肝毒性。

图2：α-amanitin，Herceptin与Herceptin- amanitin针对SKOV-3细胞系的细胞毒性，payload高度的亲水性导致其无法被动的透过细胞膜从而导致游离毒素的毒性远小于ADC

癌症基因组学分析显示，染色体17p缺失是最为常见的染色体变异，并与患者预后不良密切相关。17p染色体中有一个非常著名的TP53基因，编码的P53蛋白是细胞生长跟损伤修复的重要调节因子，在细胞的DNA受损时，P53蛋白阻止细胞停止于G1/S期，把损伤修复，如不能修复则促进细胞凋亡，有TP53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。

图3：三阴乳腺癌中17p缺失与否的生存曲线

同在17p染色体上TP53基因隔壁，还有一个POLR2A基因，该基因负责编码mRNA合成RNA聚合酶Ⅱ的亚基。因此17p缺失的肿瘤细胞上都会出现POLR2A蛋白的表达量下降两倍以上。此种程度的下调还足以维持细胞的基本生存，但是也会导致肿瘤细胞对于RNA聚合酶Ⅱ，也就是α-amanitin的极度敏感。

图4：利用曲妥珠单抗构建的α-amanitin偶联物T-Ama与T-DM1在不同细胞系的IC50数据，可见在17p intact细胞系中T-Ama的IC50会略高于T-DM1但是对17p loss的细胞系T-Ama可以低于T-DM1出2-3个数量级

Structure-activity relationship（SAR）  

Heidelberg在构建ADC时候筛选了一些结构并发表了出来，如图5所示，色氨酸的6′-OH保留与否（蓝圈），到底用硫醚还是亚砜（红圈）；偶联位点选在色氨酸上（AA4）还是天冬酰胺（AA1），所有结构都使用cleavable Val-Ala linker。同时考察了HER2, PSMA和CD19三种不同靶点的抗体以及多种细胞系JIMT-1, SKBR-3, BT474 and NCI-N87 (used for anti-Her2-ATACs); LNCap, 22RV1, MDA-PCa2b and C4.2 (used for anti-PSMA-ATACs); Raji, Raji Luc, Nalm-6 and MEC-2 (used for anti-CD19-ATACs)

小鼠耐受性参见下表(compound ID参见图5蓝色字体部分)，使用天冬酰胺（AA1）作为偶联位点的耐受性会稍好一些。

体外数据中三个靶点的ADC的EC50数值全部在Pico molar以内，最有效的是30.2371，随后是30.1699>30.2060>30.2347。

在小鼠的异种移植模型中（图6），使用静脉注射评估不同分子的疗效，动物在平均肿瘤体积约为120mm3时被分配到各组。在subcutaneous models中，基于6-OH-色氨酸的衍生物与基于色氨酸的衍生物相比，显示出优越的疗效。硫原子的状态和linker的偶联位点都没有观察到明显的影响。最终Heidelberg自己第一个BCMA靶点的ADC采用了移除色氨酸的6′-OH，使用硫醚结构并在天冬酰胺处偶联的HDP 30.2115模式。

Heidelberg自己第一个BCMA靶点的ADC采用了HDP 30.2115模式。

ATAC介导的ICD效应以及与ICI的联用   再说回bystander killing的问题，在2021年的ADC San Diego会议上，主持人对Heidelberg Pharma的代表提出的问题是：“既然你们的payload如此亲水，那么是不是意味着它没有bystander killing effect？” Heidelberg的小哥也只能嘿嘿一笑，委婉的表示我们也有bystander killing effect，只是我们的bystander killing不是分子扩散介导的（这个是传统上认为的bystander killing），而是免疫介导的（实际就是没有嘛）。 关于这个免疫介导的bystander killing effect其实很简单，Heidelberg通过实验数据证明了α-amanitin的ADC可以在杀伤肿瘤细胞后诱导比较强烈免疫原性细胞凋亡（immunogenic cell death，ICD），因此又蹭上了免疫治疗的东风，准备跟PD1进行各种combo。如图8所示，在BT474细胞系经过不同处理之后，三种ICD的biomarker，钙网蛋白Calreticulin, HMGB1和ATP的数据。美登素孵育后的样本中ATP浓度明显低于HER2-ATAC，也就是上文的T-Ama，而ATP在ICD起到了重要的作用，可以作为趋化因子招募DC等免疫细胞并作为营养因子维持DC细胞存活而且还可以促进未成熟的DC细胞分化成成熟的DC细胞。游离Amanitin由于亲水性对BT474细胞都没什么杀伤所以数据基本跟未处理的一样，CD79b-ATAC作为阴性对照数据也类似，只有HER2-ATAC能明显的同时提升三个biomarker的数据。

除此之外,ATAC还可以提升NK细胞对于肿瘤的杀伤效果，如此种种都表明免疫系统被ATAC激活了，因此Heidelberg也考察了ATAC与PD-L1抗体Avelumab的联用效果，如图9所示，联用明显的提高的治疗效果。

结论

如上所述，Heidelberg基于α-amanitin的ADC平台的优点如下：  

1. 高度的亲水性导致透膜性变差，减少的off target毒性的出现，也减少了ADC的聚集；

2. 对于处在不同生命周期的细胞都可以进行高效的杀伤；

3. 对17p缺失的肿瘤细胞杀伤效果尤其强烈；

4. 独特的作用机理可以减少肿瘤细胞针对毒素耐药性的出现（不会被MDR泵出细胞，绕过RNA聚合酶Ⅱ也很难）；

5. 强大的介导免疫原性细胞凋亡的能力，与ICI联用可以进一步提升药效（其实其他ADC多多少少也有此类功能，比如荣昌生物的RC48就通过与君实的PD1联用在尿路上皮癌上取得了非常好的效果）

说一千道一万药物这个东西还是要看最终的临床数据，Enhertu通过高DAR，中低毒性payload的途径提高了dose，增强了tumor penetration以及  bystander killing的效果，达到了重新定义HER2分型的效果；而 α-amanitin缺失的传统的分子扩散介导的bystander killing而通过增强对17p缺失肿瘤细胞的强力杀伤和介导ICD弥补这个方式到底有多有效，还是需要等临床数据出来从而证明自己的实力了。  

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