科研丨北京科大＆内蒙古农大: 益生菌干酪乳酪杆菌Zhang联合酵母多肽显著改善大鼠运动性能(国人佳作)

编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

益生菌和多肽可能提高运动性能，但两者结合对运动性能的影响尚不清楚。本研究分析了酵母多肽(YP)和干酪乳酪杆菌Zhang(LCZ)对大鼠运动性能的影响。将大鼠随机分为4组，进行10周的饮食干预，即正常对照组(NC)、多肽组(YP)、益生菌组(LCZ，4×109 CFU/d)和YP+LCZ组(YPZ)，并监测运动时间、免疫因子、肠道菌群和血清代谢物等多种参数。本研究结果表明，YP和LCZ共同作用可显著改善大鼠的运动时间，其有益作用可能是通过影响肠道菌群和血清代谢物来实现的。本研究提出了一种通过补充益生菌和酵母多肽来提高运动性能的新方法，为功能食品的开发提供了新的策略。 

论文ID

原名：Co-administering yeast polypeptide and the probiotic, Lacticaseibacillus casei Zhang, significantly improves exercise performance

译名：益生菌干酪乳酪杆菌Zhang联合酵母多肽显著改善大鼠运动性能

期刊：Journal of Functional Foods

IF：5.223

发表时间：2022.7

通讯作者：张勇、孙志宏

通讯作者单位：北京科技大学化学与生物工程学院、内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1016/j.jff.2022.105161

实验设计

本研究将40只雄性大鼠随机分为对照组(NC组，普通饲料+1 mL生理盐水)、酵母多肽组(YP组，YP饲料+1mL生理盐水)、干酪乳酪杆菌Zhang组(LCZ组，普通饲料+1 mL LCZ，4×109 CFU/mL)、酵母多肽+干酪乳酪杆菌Zhang组(YPZ组，YP饲料+1 mL LCZ，4×109 CFU/mL)，每组10只，YP饲料中含有2%的YP粉末，饮食干预10周。在10-12周进行运动耐力训练，所有大鼠在电动跑步机上进行训练(速度为0.39 km/h)，每天一次，持续14天，排除训练期间无法适应跑步机或脚部受伤大鼠，在第13周进行耐力测试。分别在0、10周采集大鼠粪便样品以及在10、13周采集血液样本用于各项指标测定。

前言

补充益生菌和多肽可能提高运动表现，然而两者结合对运动性能的影响尚不清楚。 研究表明，肠道菌群通过适应性调节能量代谢、炎症反应、抗逆性和氧化应激等途径，从而改善运动性能。某些肠道菌群通过促进短链脂肪酸(SCFAs)的产生，向肠道上皮细胞提供能量，并产生兴奋性神经递质去甲肾上腺素和多巴胺，促进运动表现。最近的一项研究揭示了肠道微生物与宿主代谢、能量利用和储存之间存在紧密的协调联系。 先前的研究表明，益生菌可以提高营养物质的利用和能量代谢，保护肠道的完整性，发挥抗炎作用，并抑制d-乳酸的积累。干酪乳酪杆菌Zhang是一种革兰氏阳性菌，大量研究表明LCZ具有多种生物学作用，如改善粪便微生物群、诱导癌细胞凋亡、抗炎、抗菌、抗氧化活性等，长期服用可稳定成人肠道菌群，降低老年人肠道菌群年龄指数。生物活性肽是对身体功能有积极影响的特定蛋白质片段，它们通常在蛋白质序列中不活跃，但可以通过酶水解或微生物发酵释放。这些肽的一些促进健康的功能包括提供能量和清除体内不良的代谢物和自由基，当碳水化合物代谢不能满足人体的能量需求时，多肽比完整的蛋白质更容易被利用来产生能量。酵母多肽是一种生物活性多肽，通过酵母蛋白的生物酶解分离纯化得到，是高质量的蛋白质来源，接近粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐的理想蛋白质氨基酸组成。 本研究旨在探究LCZ对健康促进作用和多肽在能量供应方面的高效率以及评估LCZ和YP在大鼠模型中对运动性能的影响。通过多种生理参数来评估运动性能，包括运动时间、免疫因子、粪便微生物群和血清代谢物。此外，通过对大鼠粪便微生物组和血清代谢组变化进行深入生物信息学分析，探讨了其有益作用的潜在机制。本研究提供的信息可能为功能性运动食品或补充剂的设计提供新的见解，最终有助于促进人类健康和提高生活质量。

结果

1 使用YP和/或LCZ可提高运动耐力 

生长性能和运动耐力的下降是身体疲劳的典型表现，因此我们评估了单独或联合补充YP和LCZ对大鼠生长性能和运动健康的影响。各组间前10周的体重、食物、饮水量均无显著性差异(图1b、c、d)，在旋转跑步机上进行2周的运动训练后，通过耐力测试来评估大鼠的运动性能。YP组、LCZ组和YPZ组大鼠的平均运动时间分别为47.68±7.88 min、46.89±7.80 min、49.42±5.83 min，均长于NC组(42.64±6.73 min)，然而仅在NC组和YPZ组之间存在显著性差异(P=0.016；图1e)，与NC组相比，LCZ、YP、YPZ组的跑步耐力分别提高了4.25 min、5.04 min和6.78 min。这些结果表明，与NC组相比，YPZ改善了大鼠的运动表现。 为了进一步研究酵母多肽联合LCZ对运动后其他生理指标的影响，我们测量了大鼠运动前、运动后和运动后20分钟的乳糖和血糖水平。结果显示运动20分钟后，与NC组和LCZ组相比，YPZ组大鼠血糖水平明显降低，运动后大鼠血液中乳糖水平均升高，但两组间无显著性差异，而运动20分钟后，YPZ组与LCZ组的乳糖水平存在显著差异(表S1，P=0.023)。总之，这些结果表明YP和LCZ联合使用对大鼠运动20分钟后的乳糖和血糖水平有更大的影响。

图1 实验设计与大鼠的体重、摄食量、耗水量和平均运动时间。(a)将40只大鼠分为4组(剔除体弱大鼠和样本缺失大鼠后，NC=10, YP=10, LCZ=10, YPZ=10)，给予不同处理。10周后采集粪便和血液，12周时进行耐力测试。(b)采用Wilcoxon检验比较正常对照组(NC)、酵母多肽组(YP)、益生菌组(LCZ)和YP+LCZ组(YPZ)的体重、饮食、用水量和平均运动时间。 

2 给予YP和/或LCZ可调节肠道菌群组成 

为了评估LCZ和/或YP干预对肠道菌群的调节作用，对Shannon多样性指数进行分析发现，各组间无明显变化(P>0.05；图2a)。PCoA和Adonis显示，NC组与YPZ组之间的肠道菌群结构存在显著差异(R2=0.15，P=0.001)，而NC组与其他处理组之间无明显差异(YP：R2=0.06，P=0.21；LCZ：R2=0.09，P=0.08；图2b)，表明YP和LCZ共同调控大鼠肠道菌群结构。 差异丰度分析显示，NC组和其他处理组之间分别有8个和12个差异丰富的属和种(均为P<0.05；图2c)。在属水平上，与NC组相比，YP组Roseburia和Parabacteroides相对丰度显著增加；LCZ组Akkermansia和Escherichia显著增加；YPZ组Escherichia显著增加，而Brachybacterium，Desulfovibrio，Brevibacterium，Dietzia和Enterococcus显著降低(P<0.05；图2c；表S2)。在物种水平上，与NC组相比，YP组的Bacteroides dorei和Parabacteroides distasonis相对丰度显著增加；LCZ组中Bacteroides dorei、Escherichia sp.、Escherichia unclassified、Akkermansia muciniphila和Lachnospiraceaebacterium 1157FAA显著增加；YPZ组Limosilactobacillus reuteri显著升高，而Lactobacillus hominis、Desulfovibrio desulfuricans、Bacteroidescaccae、Alistipes indistinctus、Dietzia sp.和Enterococcus faecali显著降低(P<0.05；图2c；表S2)，并且YPZ组中Escherichia unclassified和Escherichia sp.均明显升高。

图2 大鼠粪便的微生物多样性及物种分类。

第10周酵母多肽(YP)、益生菌(LCZ)和YP+LCZ (YPZ)与正常对照(NC)的(a)Shannon多样性指数和(b)主坐标分析(PCoA)评分图。代表这两组样本的符号用不同的颜色表示。(c)在属和种水平上，YP、LCZ和YPZ在第10周与NC相比有显著差异。采用Wilcoxon检验来评估统计学差异；P值采用Benjamini-Hochberg进行校正。 

3给予YP和/或LCZ可调节血清代谢组 

为了进一步揭示大鼠对饮食干预的生理反应，我们监测了其血清代谢组的变化。通过PCA分析，在所有两两比较中都观察到血清代谢组的显著差异，这可以通过PCA评分图上不同基于组的聚类模式来说明(图3a)。使用MetaboAnalyst进行代谢谱分析，用R2和Q2分别表示拟合优度参数和预测能力参数，这是PLS-DA模型的准确性和可预测性的指标，当前的研究结果达到了较高的R2和Q2值(均>0.75)，同样地，YP、LCZ、YPZ组(尤其是YPZ组)的运动时间分布与NC组有显著差异，表明对照组的血清代谢组与其他三个干预组有明显差异。 火山图显示了有显著差异的代谢物(VIP˃1，倍数变化˃2或<-2，P<0.05；图3b；表S4)。代谢物的数量在各组之间存在差异，与NC组相比，差异代谢物数量为：YP组46种(增加15种，减少31种)，LCZ组87种(增加33种，减少54种)，YPZ组119种(增加56种，减少63种)。Venn图显示了这些差异丰富的代谢物在各组中的分布(图3c)，其中8种是常见的，分别是溶血磷脂酰乙醇胺、天冬氨酸、6-姜酚、L-精氨酸、烟酰胺、氨基己酸、甲基胆碱和N-乙酰血清素。其中YP和/或LCZ驱动了10种差异显著代谢物的调节。 随后我们预测了代谢途径(图3d)，即精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、氨基酰基-tRNA生物合成、组氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成、β-丙氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢，这些结果支持了YP和LCZ共同干预对大鼠产生特定的生理作用。

图3 大鼠血清代谢组的变化。(a)PCA两两比较，血清代谢组均存在显著差异。(b)火山图中显著差异丰富代谢物(VIP˃1，倍数变化˃2或<-2，P<0.05)。(c)Venn图显示了各组差异丰富代谢物的分布。代表三组样本的符号用不同的颜色表示。(d)显示YPZ组中预测的代谢途径的横条形图。 

4 给予YP和/或LCZ可调节肠道宏基因组的代谢潜力 

使用KEGG数据库对肠道宏基因组进行了注释，并确定了两组间存在显著差异的通路，这可以预测饮食干预后肠道宏基因组代谢潜力的变化。与NC组相比，YP组葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解途径丰度显著增加(P<0.01)，LCZ组四氢叶酸生物合成和回收途径、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解、甲基乙二醛降解超途径和四氢叶酸生物合成超途径显著降低(P<0.01)，而dTDP-D-β-呋喃型岩藻糖生物合成显著增加；YPZ组精氨酸和多胺合成超途径、多胺合成超途径I、丙酮酸发酵制己醇、异丙醇合成超途径显著增加(P<0.01)，而L-瓜氨酸合成超途径、糖酵解和脱氧酮糖酸超途径、戊糖磷酸途径、L-谷氨酸降解IV、L-瓜氨酸代谢超途径、L-蛋氨酸生物合成超途径(巯基化)、L-鸟氨酸降解II、葡萄糖和木糖降解超途径、硫酸盐同化和半胱氨酸生物合成超途径、L-缬氨酸降解超途径I等均显著降低(P<0.01，图4a；表S3)，这些结果支持了YP与LCZ联合也可以调节肠道微生物代谢潜能和相应的代谢途径。

图4 (a)使用KEGG数据库对肠道宏基因组进行了注释，并确定了两组间存在显著差异的通路(P<0.01)。(b)联合给药LCZ和YP可协同提高运动表现和耐力，这反映在大鼠的平均跑步时间上。示意图说明了其有益作用可能是通过影响宿主肠道菌群和代谢来实现的。 

5 给予YP和/或LCZ可调节四种细胞因子的血清水平 

采用ProcartaPlex多重免疫分析法评估饮食干预后血清细胞因子(包括21个细胞因子)的差异，大多数(17/21)分析的炎症细胞因子在NC组和其他饮食干预组之间没有表现出显著差异，包括TNF-α、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、GRO-α、Rantes、Eotaxin、IP-10、MCP-1α和MCP-3(表S5)。有4种发生显著变化的细胞因子，即IL-1α(NC组，85.54±137.51 pg/mL；LCZ组20.54±14.96 pg/mL；P=0.0412)、IL-17(NC组21.37±19.37 pg/mL；LCZ组10.23±1.99 pg/mL；P=0.0102)、IL-5(NC组35.25±30.44 pg/mL；YPZ组，46.33±19.76 pg/mL；P=0.0461)和MIP-2(NC组，1065.13±1418.35 pg/mL；YPZ组，272.67±73.2 pg/mL；P=0.0011)。

讨论

益生菌和多肽已被证明可以改善运动性能和肌肉质量，然而益生菌联合多肽的膳食干预却鲜有报道。YP和LCZ先前都已被证明对宿主具有良好的作用，如抗氧化、抗炎症、增强免疫力和维持结肠内稳态。因此本研究比较了YP和LCZ单一或联合应用对运动性能、肠道微生物组、血清代谢组和细胞因子的有益影响。结果表明，YP和LCZ有效地提高了宿主的运动耐力，这些有益的功能可能是通过调节宿主肠道菌群和代谢来实现的。 体重是反映生物体健康状况的重要指标，它反映了能量代谢与食物摄入量的动态和平衡。所有四组大鼠的体重均以健康的方式逐渐增加，并没有发现显著差异，表明补充YP和/或LCZ不会对实验期间大鼠的健康产生负面影响，而YPZ组运动表现的改善与体重变化无关。 运动耐力是衡量运动成绩的一个重要指标，因此我们测量并分析了大鼠的跑步时间。结果表明与NC组相比，YZ和LCZ联合干预显著增加了运动时间，但在NC组与其他干预组之间没有显著差异。YP富含氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，而某些益生菌(例如Bacillus coagulans GBI-306086)已经被证明可以增加对肌肉健康特别重要的氨基酸的吸收，包括支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)和参与血液流动调节的氨基酸。同样Chen等人发现，耐力运动员的肠道中经常存在乳酸菌，这可能与该属细菌增强的蛋白质利用能力有关，它们可以提高血液中支链氨基酸的水平，维持肌肉中能量代谢的稳定状态，从而提高运动性能。在本研究中，YPZ组在运动20分钟后的血糖水平明显低于其他组，结果表明补充酵母多肽和LCZ可加速血糖恢复，这可能是改善大鼠运动表现的原因之一。 许多研究探索了肠道和肌肉之间的串扰路径，发现肠道菌群的组成和相互作用可能通过改变肠道菌群来影响肌肉的质量、功能和能量代谢，即所谓的肠-肌肉轴。肠道菌群通过适应性调节响应耐力运动的各种生理功能，包括能量代谢、炎症反应、抗应激和氧化应激，从而在运动调节中发挥作用。我们的研究结果发现，YP和/或LCZ驱动的肠道菌群结构发生了显著变化(PCoA和Adonis显示)，但微生物群多样性没有发生变化(Shannon指数)。 然后深入研究了饮食干预后肠道菌群组成的变化，YPZ组肠道菌群变化较YP和LCZ组更明显。此外，这些差异丰富的细菌在一些不良的肠道菌群中相对丰度降低，如Bacteroides caccae，Enterococcus faecalis和Desulfovibrio desulfuricans。先前的研究表明疲劳的运动小鼠肠道菌群失衡，致病菌增多，导致肠道氧化损伤。Enterococcus faecalis可产生细胞外超氧化物和过氧化氢，破坏结肠上皮细胞。此前的一项研究发现，与健康人群相比，Bacteroides caccae在痛风患者中富集，Desulfovibrio可能通过肠-肝轴促进肝纤维化的发展。综上所述，YP与LCZ联合施用可调节肠道菌群含量，尤其对不良菌群有抑制作用。 在KEGG注释结果中，YPZ组的通路丰度变化最为明显，先前的研究证明在饲粮中添加Limosilactobacillus reuteri LR1可增强断奶仔猪肠-肝轴mTORC1信号通路的氨基酸代谢。这些作用可能是由于LR1菌株提高了肠道氨基酸转运体的表达，促进了肠道黏膜对氨基酸的吸收。本研究的粪便宏基因组分析结果发现，YPZ组Limosilactobacillus reuteri的丰度显著增加；精氨酸和多胺合成超途径的丰度显著增加，表明YP和LCZ共同作用不仅促进了肠道精氨酸和多胺生物合成超途径，还促进了氨基酸的供应和能量代谢，这可能间接影响运动性能。 与其他干预组相比，YPZ组的血清代谢组变化最大，其特征是N-乙酰5-羟色胺和二氢辣椒素的含量增加。N-乙酰5-羟色胺是哺乳动物松果体中松果腺褪黑素的尿液代谢物，它是一种特殊的抗氧化剂，因其两亲性特性允许它通过生理屏障，从而减少脂质、DNA和水细胞环境中的氧化损伤，因此N-乙酰5-羟色胺被认为是一种抗疲劳的生物标志物。二氢辣椒素已被证明可以改善线粒体的生理功能和ATP的产生，通过膳食中的辣椒素激活瞬时受体电位香草素1(TRPV1)，上调骨骼肌中的PGC-1α，刺激线粒体呼，改善能量代谢和运动耐力。本研究的另一个发现是，运动后血清L-精氨酸水平显著降低，但粪便中精氨酸生物合成途径的丰度显著高于运动前。当碳水化合物在长时间的中等强度运动中耗尽时，肝脏可能会通过生酮和糖异生合成新的能量代谢底物，同时葡萄糖-丙氨酸循环被激活，其中氨基酸被降解，为肌肉提供葡萄糖，因此氨基酸也被作为糖异生和生酮反应以及蛋白质合成的底物，特别是在阻力运动后。在这些反应中使用氨基酸最终会降低其在血清中的水平，粪便精氨酸生物合成和相关通路丰度的增加可能是肠道菌群对运动后增加的氨基酸底物做出的反应。 炎症是身体的一种保护性反应，可以帮助身体清除入侵的病原体，中和有害刺激，并启动组织修复。本研究分析了四组大鼠血清中的21种细胞因子，饮食干预组与NC组相比无显著性差异，表明YP和/或LCZ干预未引起大鼠剧烈炎症反应。另一方面，IFN-γ和TNF-α是典型的促炎细胞因子，通过促进凋亡细胞死亡来激活细胞信号转导途径。Th1细胞因子(如IFN-γ)可促进迁移抑制因子(MIF)介导的巨噬细胞内吞作用，MIF可招募中性粒细胞和T细胞，促进其增殖和分化产生促炎细胞因子。研究发现，Limosilactobacillus reuteri可减少脊髓炎症细胞浸润，特别是侵袭T细胞(CD3+)和巨噬细胞(CD68+)，减少产生IFN-γ的TH1细胞。本研究发现，与NC组相比，运动前YPZ组血清IFN-γ和TNF-α水平均无明显下降，YPZ组粪便中Limosilactobacillus reuteri平均相对含量显著升高，血清MIP-2和IFN-γ水平下降。这些结果表明，YP和LCZ共同作用对宿主产生 了炎症反应。

结论

本研究表明，摄入干酪乳酪杆菌Zhang和酵母多肽可有效提高大鼠的平均运动时间，这些有益作用可能是通过影响大鼠的肠道菌群和血清代谢来实现的。本研究不仅进一步拓宽了肠道菌群和人类健康的研究方向，而且为功能性食品的开发提供了新的策略。 

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464622002316