无中生有！罕见螺旋肽的人工合成

蛋白质作为承载生命活动的生物大分子以及生命体的重要组成部分，其功能取决于它们具有精确定义的结构和动态特性复杂折叠的能力，在生物学各个领域中都被广泛地研究。为便于理解蛋白质复杂的结构，通常将蛋白质结构分成一级结构、二级结构、三级结构、四级结构这四个组织层次。其中，在蛋白质折叠过程中，主链极性基团与溶剂水之间或相互之间形成氢键，出现了由氢键稳定的有规则的构象，称为二级结构 (Secondary structure)。二级结构是蛋白质复杂三维结构的结构基础，因而被称为构象元件 (element)。

图 1 蛋白质结构的类型

α 螺旋 (α helix) 是蛋白质中最常见、最典型和含量最丰富的二级结构元件1。它是结构生物学的基石、蛋白质折叠研究的模型、蛋白质设计的主力军以及在蛋白质工程和生物技术中得到广泛应用2’3’4。此外，在蛋白质中还存在几种其他类型螺旋，包括 310 螺旋 (310-helices) 和 π 螺旋 (π-helices)5，但它们在蛋白质结构中的出现频率要低得多，不太有利的内部能量和减少堆积成高级结构的趋势意味着天然蛋白质中 310 螺旋的长度很少超过六个残基，并且它们往往不会形成正常的超二级、三级或四级相互作用。

2022年6月22日，英国布里斯托大学的 Derek N. Woolfson 实验室与 Jonathan Clayden 实验室合作，在 Nature 期刊上发表了题为 De novo design of discrete, stable 310-helix peptide assemblies 的论文。论文迭代设计了稳定的水溶性 310 螺旋束，揭示了 α 螺旋和 310 螺旋折叠之间的临界点，并确定了稳定 310 螺旋组件所需的特征，为设计进入这个迄今为止尚未探索的蛋白质结构空间区域提供了理论基础。

为什么α 螺旋比许多其他的构象更容易形成呢？一部分原因是因为它能最大程度地利用内部氢键。从 N 端出发，α 螺旋的氢键是由每个肽基的 C=O 与 C 端的第4个肽基的 N-H 之间形成的 (COi → NHi+4)。每一连续的α 螺旋圈都由3到4个氢键固定住相邻的螺圈，这样给予整个螺旋结构以很大的稳定性。相比之下，310 螺旋和 π 螺旋具有不同的螺旋参数，分别以 COi → NHi+3 和 COi → NHi+5 的模式形成氢键，导致更紧密和更松散的螺旋结构。由于这两种螺旋中的氢键几何结构及非键合相互作用并不处于最佳状态，因此在热力学上不太稳定。因此，这些螺旋构象在天然蛋白质中较少出现并不意外。

研究者们调查已有的蛋白质结构发现，310 螺旋和 π 螺旋的出现概率比 α螺旋少得多，且长度也短得多。此外，研究者们还发现几乎没有 310 螺旋和 π 螺旋通过超二级、三级或四级相互作用整合形成蛋白质。显然，这就引发出了两个问题：（1）自然界中是否仍然存在由 310 螺旋或 π 螺旋组装形成的蛋白质？（2）研究者们能否制造出这类蛋白质呢？

图 2 分析 310 螺旋的 PDB 和设计原则

一些天然肽内确实包含 310 螺旋构象的区域，但其疏水性会降低肽在水中的溶解度。因此，研究者们大胆地推测，如果能从头设计一个合成序列，形成一个足够长度的两亲性 310 螺旋——即具有明显疏水面和极性面，它可以通过螺旋-螺旋相互作用来稳定以形成一个 310 螺旋束。

结合生物信息学，研究者们发现，对于 ≥ 6 个残基的 310 螺旋，对 310 螺旋二级结构具有强偏好性的残基包括谷氨酸 (Glu, E)、赖氨酸 (Lys, K)、亮氨酸 (Leu, L) 和色氨酸 (Trp , W)。基于此，研究者设计了七个残基序列 E-L-A-A-L-K-X（其中 X 可以是任何氨基酸），将序列重复四次以制备肽 PK-1。

接下来，通过圆二色谱 (CD) 和分析型超速离心技术 (AUC)，研究者发现 PK-1 采用 α 螺旋形成了三聚体物质，并通过 X 射线晶体衍射确定了这种结构。由于 α-氨基异丁酸 (Aib, U) 残基能稳定 310 螺旋构象，研究者替换了 PK-1 中的 Ala 残基以得到 PK-2。然而，与 PK-1 一样，PK-2 在溶液中仍然是高度 α 螺旋、热稳定和单分散的三聚体。研究者们进一步推测，链间盐桥可能会稳定此类螺旋束，从而设计了两种肽 PK-3 和 PK-4，包含四次重复的六个残基序列 E-L-Z-Z-L-K（其中 Z  分别表示 Ala 和 Aib 残基）。

实验惊奇地发现，PK-4 的 CD 光谱明显不同于之前的三种肽，且 AUC测量表明 PK-4 可以与单分散六聚体结合，形成有中心腔的桶，并具有坚固的疏水核心的紧密堆积结构。

图 3 从头设计的肽的生物物理表征

为了更直观地观察 PK-4 的形态，研究者尝试通过结晶解析 PK-4 及其衍生物的 X 射线结构。最终，研究者解析了变体 PK-5 （D-Glu，D-Lys和D-Leu以及C端D-Br-Phe 突变）的2.34 Å 晶体结构。该结构揭示了八个 310 左手螺旋的平行束，值得注意的是，PK-5 的螺旋每转具有约 3.15 个残基，以及 COi → NHi+3 氢键的九个连续转角（27 个残基）。天然蛋白质中罕见的长 310 螺旋的例子往往是不规则的，相比之下，PK-5 的 X 射线晶体结构中曲线更平滑。更详细地说，PK-5 的结构具有 C4 对称性，其中成对的相邻螺旋有助于形成内部四螺旋束和外部四螺旋环。侧链的填充是紧密的，让人想起 α 螺旋盘绕线圈中的“旋钮入孔”填充。与亲本 PK-4 相比，PK-5 采用 p-Br-Phe 代替了 Trp。PK-5 的扩展晶格揭示了八聚体的并排和头对尾堆积，其中 D-p-Br-Phe 残基堆积在一层中并与许多边对面的芳香族相互作用。将 D-Trp 残基建模到这些位点揭示了八聚体之间潜在的空间冲突，这可能部分解释了为什么 PK-4 没有结晶。因此，组装编程到两亲性 310 螺旋序列中的强大趋势可以通过序列中的细微之处进行调节，从而导致不同程度的寡聚化。

图 4 从头设计的肽的晶体结构

PK-4 和 PK-5 分别形成六个和八个 310 螺旋的平行束，这种组装在所涉及的 310 螺旋的长度以及此类螺旋的水溶性、超分子或四元组装方面都是前所未有的。随着设计目标实现，研究者们将 PK-4 和 PK-5 分别重命名为 310HD 和 D-310HD。这便引发了进一步的问题，即为什么在天然蛋白质中没有发现类似的结构，以及研究者从头设计的序列哪些特征使其如此易于形成稳定的基于 310 螺旋的四元结构？为了解决这些问题，研究者设计一系列的 310HD 的变体。

首先，研究者测试了六个残基重复序列的“亮氨酸位点”的疏水性和空间大小对 310HD 折叠和组装的影响。分别采用 Ala (PK-6)、Aib (PK-7)、Ile (PK-8) 和Val (PK-9) 替换 310HD 的所有 Leu 残基。最终证实，在蛋白质脂肪族疏水侧链中，Leu 最能促进 310 螺旋的超分子组装和稳定。

接下来，研究者测试了改变肽长度对 310 螺旋束稳定性的影响。保留整个序列重复 ELUULK，但系统地将序列重复的数量从四个减少到三个 (PK-12)和两个 (PK-10)。最短的肽 PK-10 在溶剂中是部分折叠的单体，有趣的是，PK-12 的 CD 光谱揭示了从部分 α 螺旋到 310 螺旋构象的协同浓度依赖性转换：随着肽浓度的增加，肽的寡聚状态从多个低聚体变为更高浓度的六聚体。PK-4 (310HD) 系列 → PK-12 → PK-10 表明肽长度以及疏水接缝的长度对于 310 螺旋的折叠、组装和稳定至关重要。

最后，利用 D-310HD 结构的对称性和盐桥，研究者设计了一个包含酸性(PK-13) 和碱性 (PK-14) 肽的异聚系统。当二者在溶液中分离时，两种肽各自折叠形成 α 螺旋单体。然而当混合时，二者则形成 310 螺旋，形成与 310HD 相似的单分散六聚体。

总的来说，本项研究首次实现了由 310 螺旋肽构建的水溶性超分子组装体或四元结构的合理从头设计。这些设计包含：（1）生物信息引导的简化氨基酸字母表；（2）非蛋白原α, α-二取代氨基酸Aib；（3）严格的六残基序列重复；和（4）至少三个序列重复。除了第二个特征之外的所有特征都可以通过天然核糖体蛋白质合成来实现，这就提出了为什么大自然没有发现和利用这些或类似结构的问题。尽管如此，研究者们仍然提供了决定性的证据，证实人工设计能实现稳定的 310 螺旋构象和组件。在未来的研究中，此项工作为天然蛋白质结构空间区域的新结构和功能肽化学探索开辟了新的途径。

参考文献

[1] Pauling, L., Corey, R. B. & Branson, H. R. The structure of proteins; two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc. Natl Acad. Sci. USA37, 205–211 (1951).

[2] Chakrabartty, A. & Baldwin, R. L. Stability of alpha-helices. Adv. Protein Chem. 46, 141–176 (1995).

[3] Korendovych, I. V. & DeGrado, W. F. De novo protein design, a retrospective. Q. Rev. Biophys.53, e3 (2020).

[4] Lapenta, F., Aupic, J., Strmsek, Z. & Jerala, R. Coiled coil protein origami: from modular design principles towards biotechnological applications. Chem. Soc. Rev. 47, 3530–3542 (2018).

[5] Schulz, G. E. & Schirmer, R. H. Principles of Protein Structure (Springer, 1979).