COVID-19患者肠道微生物组的短链脂肪酸和L-异亮氨酸生物合成长期受阻

编译：微科盟隔壁师兄，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

研究目的：新冠病毒感染与肠道菌组成密切相关，肠道菌群演化也参与降低了新冠感染患者的短链脂肪酸水平。本研究旨在确证新冠感染患者在疾病进展前后的肠道菌功能差异。

研究方法：本研究首先采用鸟枪法宏基因组测序检测了66例未使用抗生素的新冠患者和70例未感染新冠病毒的对照人群，分别收集了其住院期间以及出院一个月后共6个时间点的系列粪便样本，以评估其肠道菌代谢通路与疾病严重程度以及血液炎性标志物的关联。该项研究还评估了疾病进展前后的肠道菌功能改变，并通过粪便代谢物的靶向分析对这些功能进行验证。

研究结果：相比于未感染新冠的对照组，重度感染的新冠患者表现为短链脂肪酸和L-异亮氨酸生物合成的显著抑制以及尿液产生受阻（P＜.001），而且这种合成抑制在新冠患者康复后的30天内仍持续存在。对新冠患者疾病进展前后的肠道菌进行靶向分析，发现其短链脂肪酸和L-异亮氨酸含量显著降低，而不足的短链脂肪酸和L-异亮氨酸又会进一步加重病情，并增加患者体内CXCL-10、N末端B型利钠肽原以及C反应蛋白的浓度（P＜.05）。

研究结论：新冠患者的肠道菌表现为短链脂肪酸和L-异亮氨酸生物合成抑制，且在整个疾病进展过程中持续进行。这两大肠道菌功能与宿主免疫反应密切相关，表明肠道菌功能在新冠感染的疾病进展和最终预后发挥重要作用。

图文摘要    

论文ID

原名：Prolonged impairment of short-chain fatty acid and L-isoleucine biosynthesis in gut microbiome in patients with COVID-19

译名：短链脂肪酸和L-异亮氨酸生物合成在COVID-19患者肠道微生物组中会被长期抑制

期刊：Gastroenterology

IF：33.883

发表时间：2021.10

通讯作者：Siew C. Ng（黄秀娟）

通讯作者单位：香港中文大学

DOI号：10.1053/j.gastro.2021.10.013

实验设计

前言

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型 (SARS-CoV-2) 感染引起的冠状病毒病2019 (COVID-19) 与肠道微生物组成改变有关。在SARS-CoV-2感染患者中，参与短链脂肪酸 (SCFAs) 代谢的肠道细菌的系统发育群减少。本项研究旨在描述COVID-19患者在疾病治疗之前和之后肠道微生物群的功能特征。

在本研究中，前瞻性招募了66名使用抗生素治疗的COVID-19患者，并对他们从入院到出院后30天进行随访。利用宏基因组分析，对与疾病严重程度和免疫反应相关的肠道微生物群功能的改变和纵向动力学进行了表征。还采用了靶向代谢组学分析来检测粪便微生物代谢产物的变化进一步验证。

结果

1 受试者临床特征

参加本次试验的66位住院患者均为实验室确诊新冠病人，其中29位男性，年龄范围42.6 ± 19.0岁。同时有70位年龄性别匹配的非新冠感染的对照受试者，其基本统计信息及临床特征见表1和图1。其中新冠患者平均住院时间24天（IQR: 4-46天），35位患者出院后继续参加随访（中位数28天，IQR: 18-41天）。所有患者均未使用过抗生素，35位（53%）患者至少使用过一种抗病毒药物。治疗期间，53位（53%）患者出现感冒，8位（12.1%）患者出现呕吐，47位（71.2%）患者出现至少一种呼吸系统症状。所有患者根据新冠严重度划分标准，被分为严重（6.1%，n=4）、重度（22.7%，n=15）、中度（24.2%，n=16）和轻度（47.0%，n=31）。

表1. 新冠患者和对照组健康受试者的临床基本信息

图1. 66位新冠患者住院期间的粪便收集图例。“CoV”代表新冠患者，“D0”代表患者开始出现症状。

2 新冠患者肠道菌的功能改变

为了了解SARS-CoV-2感染如何影响抗生素治疗的COVID-19患者的肠道微生物群，对COVID-19患者和对照组的粪便样本进行了宏基因组测序，并对粪便微生物群进行了分类分析。首先在基线时（入院后第一次采集粪便样本）研究了轻、中、重症/危重型COVID-19患者的肠道菌群组成。COVID-19重症/危重症患者的菌群组成与非COVID-19对照组明显不同（附图1A，PERMANOVA分析，P < .001），他们与对照组的Bray-Curtis差异显著高于非COVID -19个体（附图1B，Mann-Whitney U检测，P < .05）。与非COVID-19对照组相比，COVID-19患者的主要特征是青春双歧杆菌、布氏瘤胃球菌和普拉梭菌损耗，卵形拟杆菌、多雷氏拟杆菌和多形拟杆菌富集。这些结果表明SARS-COV-2感染与肠道微生物组成的改变有关 (根据年龄、性别和合并症进行调整得到MaAalin2，P <.05，附表1)。有趣的是，在COVID-19患者中，青春双歧杆菌和F. prausnitzii的减少与更严重的症状显著相关(根据年龄、性别和合并症进行调整得到MaAalin2，P <.05，附表2)。这些结果表明SARS-COV-2感染与肠道微生物组成的改变有关。

由于COVID-19和非COVID-19受试者的肠道微生物组成存在差异，通过分析肠道微生物组的功能，包括功能基因丰度及其相应的通路，来研究这些组成差异是否转化为功能水平的差异。首先在基线时(入院后采集的第一次粪便样本)调查了轻、中、重症/危重症COVID-19患者的微生物通路组成，排除SARS-CoV-2清除后收集第一次粪便样本的患者。COVID-19重症/危重症患者的微生物通路组成与非COVID-19对照组明显不同（图2A，PERMANOVA分析，P < .001），他们与对照组的Bray-Curtis差异显著高于非COVID-19个体(图2B，Mann-Whitney U检验，P < . 05)。在检测的所有宿主因素（年龄、性别、共病、COVID-19疾病严重程度、粪便SARS-CoV-2病毒载量、抗病毒药物和饮食）中，SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病严重程度均显著影响微生物功能通路的组成，其中COVID-19疾病严重程度的效应量最大（图2C，R2 = 0.073，P <.001，PERMANOVA分析）。住院期间的饮食（详见附表3）对微生物功能途径的变化没有显著影响（图2C）。此外，与非COVID-19对照组相比，COVID-19患者粪便中微生物功能通路的丰度显著降低（图2D，P <. 05）。这些结果表明，SARS-COV-2感染也与肠道微生物群功能通路的改变有关。

图2. COVID-19患者基线时肠道微生物组功能变化

（A）采用基于Bray-Curtis异同点的非度量多维尺度图（NMDS）分析COVID-19轻、中、重症/危重症患者和非COVID-19患者的微生物功能路径组成。显著性的P值由使用PERMANOVA分析确定，并表示为∗∗P < .001。（B）基于多种途径的COVID-19轻、中、重症/危重症患者与非COVID-19对照组的Bray-Curtis差异。用Mann-Whitney U检验确定显著性P值，并表示为∗∗P < .001。（C）宿主因子对微生物路径组成的影响大小。效应量和统计学意义通过PERMANOVA分析确定。∗、∗∗、∗∗∗分别表示P < .05、P < .01和P < .001。（D）基于Chao1指数评估COVID-19轻、中、重症/危重症患者和非COVID-19患者的微生物通路丰富度。采用Mann-Whitney U检验确定COVID-19患者与非COVID-19对照组之间的统计学差异，显示∗P < .05。

3 有益菌功能的减少与其新冠患病严重程度的相关性

接下来我们研究了哪些微生物功能主要驱动COVID-19患者和非COVID-19对照组的差异。与非COVID-19对照组相比，19个微生物途径在基线时被耗尽，19个途径在COVID-19患者的粪便样本中被富集，这些样本使用DESeq2确定（所有校正P <.05），使用MaAalin2调整年龄和性别（所有校正P <.05）。COVID-19患者的19个衰竭路径中，有7个与碳水化合物降解有关，这表明SARS-CoV-2感染损害了肠道微生物降解碳水化合物的能力。在COVID-19患者中，与非COVID-19对照组相比，参与乙酸生物合成的双歧杆菌分流途径减少最多（2.4倍），而尿素循环途径增加最多（2.3倍）（附表4）。

这些数据表明，COVID-19患者的能力受损短链脂肪酸的生产能力增强，尿素循环能力增强。然后，我们通过MaAsLin2分析，将38个不同的途径与COVID-19疾病的严重程度相关联，调整年龄、性别和共病，11个主要与糖衍生物降解、l -异亮氨酸生物合成和嘌呤核苷酸生物合成相关的微生物途径，与COVID-19严重程度呈显著负相关（表2; 假发现率FDR校正P < .2），以及与碳水化合物生物合成、嘌呤核苷酸生物合成、血红素生物合成和肽聚糖生物合成相关的8个微生物途径，与COVID-19严重程度显著正相关（表2，FDR校正P < .2）。

蔗糖衍生物的降解与短链脂肪酸发酵的关键代谢产物丙酮酸的生成有关。l -异亮氨酸是微生物与宿主相互交流的重要媒介，在调节宿主先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用。COVID-19患者肠道微生物功能的改变可能对宿主的生理和功能产生重大影响。

为了确定住院是否可能导致肠道微生物群的变化，我们还纳入了因社区获得性肺炎住院但COVID-19阴性的患者（附表5）。我们发现，与肺炎患者相比，COVID-19患者的肠道微生物群功能有显著不同（附图3，P = 04，PERMANOVA分析）。通过比较COVID-19和非COVID-19对照，确定了38个富集或耗尽的微生物途径（附表4）。21个（51%）在COVID-19和肺炎患者之间也存在差异，包括与粪便中短链脂肪酸合成和异亮氨酸生产相关的途径（附表6，FDR校正P < .2）。这些数据表明，COVID-19患者肠道微生物组功能的改变不是住院的结果。

表2. 疾病严重程度密切相关的肠道菌代谢通路。

注意：使用MaAsLin2确定途径和疾病严重程度之间的相关性，并根据年龄、性别和合并症进行调整。此表仅显示FDR校正P值<0.2的通路。

  4 部分血生化指标与肠道菌短链脂肪酸及异亮氨酸生物合成密切相关

在COVID-19患者中，SARS-CoV-2感染可诱导功能失调的免疫反应，从而导致细胞因子风暴综合征，导致更严重的疾病结局在这里，我们发现血浆NT-proBNP、IL10、CXCL10、LDH、CRP和丙氨酸转氨酶水平升高，血小板计数（PLT）、白蛋白和血红蛋白水平降低（MaAsLin2，FDR校正P < .05）与COVID-19患者症状更严重显著相关（附表7），提示SARS-CoV-2感染可能引起这些变化，从而导致更严重的疾病结局。

然后，我们将血液测量的这些变化（CXCL-10, IL10, NT-proBNP, LDH, CRP，丙氨酸转氨酶，PLT和白蛋白）与微生物途径的发现联系起来（表2），以评估微生物功能是否在免疫应答失调中发挥作用。四种途径（d -半乳糖酸降解I、己糖醛酸和己糖醛酸的超降解途径、β- d -葡萄糖醛酸的超降解途径和4-脱氧- l -苏-己糖醛酸的超降解途径）与NT-proBNP显著负相关（Rho分别为-0.41、-0.48、-0.48和-0.47，图3）。L-异亮氨酸生物合成与等离子体水平负相关CXCL-10（ρ= -0.35）和C反应蛋白（ρ= -0.35）（图3）。中位数水平以上病人心脏衰竭标记, 与更多的不良临床结果COVID-19和显著增加患者住院期间的人病死率密切相关。

CXCL10是一种促炎症趋化因子，已知与COVID-19预后不良相关。这些途径可能参与预防COVID-19过度侵袭性炎症。尿素循环途径与CXCL-10呈正相关（Rho = 0.40），血红素生物合成II途径与PLT呈负相关（Rho = -0.40）（图3）。在COVID-19中，血小板计数低与严重疾病和死亡风险增加相关，因此，这两种途径的过表达可能与更多的功能失调的免疫反应相关。总之，我们的数据强调，肠道微生物群可能在功能上校准宿主对SARS-CoV-2感染的免疫，从而影响COVID-19的严重程度。

图3. Spearman相关性分析探究血生化指标与肠道菌代谢相关性。与疾病进展密切相关的通路均被列出，其中蓝圈代表正相关，红圈代表负相关，圆圈大小及颜色深度代表其相关性水平的重要性。  

  5 新冠患者康复后肠道菌短链脂肪酸和异亮氨酸的肠道菌功能被持续性抑制

为探讨患者康复后肠道菌群及其功能是否恢复，收集35例患者出院后（出院天数28天，中位数IQR为18-41天）的粪便样本（轻症15例，中度17例，重症13例;重症/危重症患者在疾病解决后与非COVID-19对照组相比，仍表现出明显不同的微生物组组成和功能能力（附图2A、B和图4A、B），尽管微生物途径的丰富程度增加到与非COVID-19对照组相当的水平（图4C）。然后，我们研究了COVID-19患者在疾病消退后是否恢复了差异分类群（附表1）或微生物功能通路（表2）。

与非COVID-19对照组相比，包括青春双歧杆菌、溴化瘤胃球菌和F. prausnitzii在内的7种细菌类群在患者基线样本中被耗尽，出院后显示出可持续的低丰度。然而，即使在疾病消除后，基线富集的拟杆菌属和拟杆菌属在COVID-19患者中仍比非COVID-19对照组显示出更高的丰度（附图2C）。

在微生物功能方面，重症患者基线样本中所有过度代表的途径在出院后都恢复到与非COVID-19对照组相当的水平。相比之下，参与SCFA和l -异亮氨酸生物合成的11个通路中，有9个在病情缓解后出现持续耗竭（图4D）。这些数据表明，在COVID-19解决后，患者的肠道微生物组功能持续受损。

图4. 新冠患者康复后肠道菌短链脂肪酸和异亮氨酸的肠道菌功能被持续性抑制。

（A）基于Bray-Curtis差异的NMDS图，观察非COVID-19对照组和COVID-19患者基线和出院后的微生物路径组成。（B）COVID-19患者基线和出院后与非COVID-19对照组的布雷-柯蒂斯差异。采用Mann-Whitney U检验确定显著性P值，并表示为∗P < .05。（C）基于Chao1指数评估非COVID-19对照组和COVID-19患者基线和出院后的微生物通路丰富度。采用Mann-Whitney U检验，∗P < .05，表明COVID-19患者与非COVID-19对照组相比具有统计学意义。（D）COVID-19患者出院后肠道微生物功能变化热图。右边的标签显示了微生物的途径。相对丰度高的途径为红色，而相对丰度低的途径为蓝色。

6 新冠患者粪便中短链脂肪酸和异亮氨酸浓度下降

粪便代谢组提供了微生物活性的功能指数，并可被用作介导宿主-微生物组相互作用的媒介。我们发现肠道微生物功能的变化与肠道微生物代谢物的变化是一致的：在COVID-19患者中，与短链脂肪酸和l -异亮氨酸产生相关的几个途径被消耗，尤其是那些重症/危重症患者（附表4和表2）。在基线时（入院后采集的第一个粪便样本)，COVID-19重症/危重症患者的粪便含量显著低于非COVID-19对照组（图5A-G)。新冠肺炎患者l -异亮氨酸浓度也低于对照组（P < 0.05，图5 H）。

这些结果进一步表明，SARS-CoV-2感染可能与肠道微生物产生短链脂肪酸和l -异亮氨酸生物合成能力受损有关。有趣的是，在疾病缓解30天后，重症/危重症患者的丁酸、戊酸、己酸和l -异亮氨酸浓度仍显著降低，这支持了SARS-CoV-2感染可能对肠道微生物组功能造成长期影响的观点。此外，我们发现COVID-19患者粪便丁酸水平与血浆IL10、CXCL-10、CRP呈显著负相关，与白蛋白呈显著正相关（均P < .05，附图4）。l -异亮氨酸与CXCL-10呈负相关，与PLT呈正相关（均P < .05，附图4）。这些结果表明，微生物来源的丁酸盐和l -异亮氨酸可能参与了预防COVID-19过度炎症的过程。

这些途径中没有一条是由单一物种主导的，这表明这些途径的改变可能是由它们在群落水平上的功能变化所决定的（附图5）。值得注意的是，这种细菌短链脂肪酸生成通路是主要贡献者（附图5A-D）和产生l -异亮氨酸的途径l -异亮氨酸生物合成I和l -异亮氨酸生物合成III（附图5E和F），提示F. prausnitzii可能在对抗SARS-CoV-2感染中发挥有益作用。

图5. 新冠患者与其对照健康受试者粪便中乙酸(A)、丙酸(B)、丁酸(C)、戊酸(D)、己酸(E)、异丁酸(F)、异戊酸(G)和L-异亮氨酸(H)的浓度水平。入院后第一次采集的粪便样本（基线组）和出院后采集的粪便样本（康复后组）用于目标代谢组分析。根据Mann-Whitney U检验，∗P <. 1，∗∗P<. 01和∗∗∗P<. 001表示轻度、中度和重度/危重型患者与非COVID-19对照相比具有统计学意义。

讨论

曾有文献报道新冠患者相比于其对照组，真杆菌科、粪杆菌科、玫瑰杆菌科、双歧杆菌科和毛螺杆菌科等肠道菌含量均为较低水平，从而影响了新冠患者的治疗。然而其作用机制至今都未被阐明。据我们所了解，这项研究是在学界第一次提出了新冠患者肠道菌功能对新冠疾病进展的影响。

短链脂肪酸，包括丁酸及乙酸、丙酸均可通过抗炎免疫系统抑制炎症通路来发挥抗炎作用。此外，丁酸还可以维持肠道屏障来阻止肠道内毒素和细菌的侵入与循环，从而减少了系统性炎症反应的发生。最近，丁酸被研究发现可以通过调控新冠感染的关键基因来保护宿主免受病毒感染，比如血管紧张素转化酶ACE2表达下调以及肠道内皮器官模型的Toll样受体抗病毒通路的上调。

在这项研究中，我们则通过新冠患者粪便代谢物证明了短链脂肪酸直接影响了新冠感染的进展，并提示粪便中减少的丁酸水平与患者血浆中的促炎因子IL-10和趋化因子CXCL-10密切相关，从而证明了短链脂肪酸在新冠病毒感染致病过程钟的重要性。直接补充短链脂肪酸或补充能够生成短链脂肪酸的益生菌能否潜在改善新冠患者治疗？这一问题仍有待进一步的实验证据证明。值得注意的是，新冠患者在治疗期间以及康复30天后的短链脂肪酸生物合成能力的抑制，可能会因其在机体免疫和代谢中的关键作用导致长期的健康并发症。

肠道菌在调控氨基酸消化和吸收中也发挥着重要作用，从而影响着机体的多种生理机能。我们第一次发现了新冠患者肠道菌在异亮氨酸合成能力方面的下降，近期研究证实异亮氨酸可能会引发机体保护多肽的表达升高，如β-防御素。这些多肽可以调控机体固有性免疫以及适应性免疫反应，从而减轻致病原对人体和动物的不良作用。基于此，我们发现了异亮氨酸生物合成I通路以及粪便异亮氨酸均与疾病恶性程度、促炎因子CXCL-10呈显著负相关。

这些结果共同说明肠道菌代谢生成的异亮氨酸会通过调控机体对新冠病毒的免疫反应来减轻新冠患者的疾病严重程度。此外，异亮氨酸作为支链氨基酸之一被认为是缓解中枢和肌肉疲劳的营养源，其机制为增加血清中疲惫分子（乳酸，氨和五羟色胺）、能量代谢物（葡萄糖和自由脂肪酸）以及肌肉疼痛物质（肌酸激酶和乳酸脱氢酶）的浓度。有趣的是，这项研究发现新冠患者康复后。其异亮氨酸生物合成仍然被持续抑制，从而导致粪便异亮氨酸含量降低。这可能部分解释了为什么新冠幸存者被报道持续的肌肉虚弱和疲惫症状。

值得注意的是，我们发现主要是普拉梭菌参与抑制了新冠患者的短链脂肪酸和异亮氨酸的生物合成能力。除了曾经文献报道的普拉梭菌含量降低，本研究提供了更多的普拉梭菌对新冠疾病进展中的作用，这也提示我们之前一直低估了这个菌种在新冠感染中的重要意义。

众所周知的是，肠道菌依赖的尿素代谢参与了机体的尿素平衡以及多种疾病进展。我们发现了新冠患者肠道菌的尿素循环通路激活，且与疾病严重程度呈正相关。有文献表明新冠患者血清中尿素含量高于健康人群，肠道菌的改变可能也与病毒感染阶段尿素循环功能的扰乱具有关联。然而，这种尿素循环的扰乱具体如何影响了疾病进展仍需要进一步探究。

这项研究有以下几点优势：受试者均未参与已知影响肠道菌的抗生素的干预，并且在数次粪便收集后一直保持出院后的长期随访。这一重大发现提示一个人肠道菌功能特征的改变会在病毒清除后仍持续存在（比如短链脂肪酸的生物合成），这也就解释了所谓的“长期新冠”导致的疲乏和肌肉虚弱等症状。

尽管上述仅是猜想，但值得更多的研究。由于医院饮食也会影响肠道菌功能的改变，我们收集了患者在住院期间的全部饮食记录，发现其实这些患者的饮食并没有显著影响肠道菌的功能改变。

总体来说，饮食的改变不太可能影响我们的研究结论。然而这项研究也有一些不足：我们没有拿到新冠对照组以及19位新冠受试者在疾病进展前的饮食记录，尽管医院饮食和香港当地饮食习惯基本一致，但还是妨碍了我们调查肠道菌在新冠前后肠道菌最为真实的变化。而且这项研究是一个观察性研究，其不能推断出肠道菌功能改变具体如何影响了新冠患病的严重程度，以及病毒自身是否引发了这种变化。

进一步的研究应该去探索这些肠道菌功能的改变是否直接影响了新冠患者的恶性程度，或者他们是否仅仅是肠道感染引发的免疫反应。此外，进一步的机制研究应该去了解确证短链脂肪酸和异亮氨酸对疾病严重程度以及阻止病毒感染的作用。而且也想知道上述肠道菌功能改变是否也存在于其他地区的新冠患者。

结论

这项研究证实了新冠感染导致的肠道菌功能改变，比如减弱的短链脂肪酸和异亮氨酸生物合成以及上调的尿素生成。这就明确提出了新冠患病严重程度与肠道菌之间的密切联系，为阐明肠道菌在新冠感染进展过程的重要作用奠定了坚实基础。

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