血小板检测功能专题（11）神奇的大自然，天然的αIIbβ3受体拮抗剂

大自然中的很多物质，具备天然的抗凝或抗血小板效应，很多临床应用的药物，都来自于对这些生物体的研究。 学习本文，了解这些物质。

自然界中，有很多讨厌的虫子，令人不胜其烦，甚至令人恐惧。然而，大家是否知道，这些虫子，可能对药物的研发会做出巨大贡献？ 在抗血小板药物研发领域，很多重要的抗血小板药物，实际上来源于这些虫子的唾液腺分泌物或者毒液，可以称为 天然抗栓药物（Antithrombotic Agents from Nature ）。 嗜血寄生虫 （Hematophagous parasite），例如 蚊子(Mosquitoes)、 蜱(Ticks)、 虫子(Bugs)、 水蛭(Leeches)、 沙蝇(Sandflies)、 钩虫(Hookworms)和 蝙蝠(Bats)等，可表达多种 抗凝 血和 抗血小板的蛋白，对抗宿主的止血系统，防止血液凝固，允许它们长时间进食。 （部分嗜血昆虫，见Figure 1 ） Figure 1. 

一些常见嗜血昆虫

这些生物体是开发新药主要 先导化合物(Lead compounds)的来源，也是治疗止血障碍或者心血管疾病潜在有用的治疗剂。 

源自嗜血寄生虫的 抗凝血肽(Anticoagulant peptide)，一个著名的例子，就是 水蛭素(Hirudin)。 水蛭素（分子量：7 kDa）是从 水蛭的 唾液腺（salivary glands）中分离出来的。 水蛭素和凝血酶形成复合物，从而 抑制凝血酶 的活性。在临床中，已经开发出相应的直接凝血酶抑制剂，用于急性心梗，动静脉血栓的防止。 

蛇类，尤其是 蝰蛇（Vipers），其腺体中有丰富的 毒液（Venom），富含多种酶，肽，在细胞毒性，神经毒性方面起着非常复杂的作用。其中，也富含调节 血液凝固的蛋白质，从而导致器官退化和全身组织损伤。 这些 血液毒性（Hemotoxic） 蛋白质的功能 不仅仅是固定猎物(Immobilize the prey)，也有助于其消化。 蛇毒(Venom)已成为药物研发的宝贵来源。对于抗血小板聚集，在蛇毒中发现了一种有趣的多肽，叫做 去整合素（Disintegrins）。 （Figure 2）

Figure 2 源自蛇毒中开发的药物

源自蛇毒的抗血小板药物---Tirofiban(替罗非班），Eptifibatide(依替巴肽）、

源自蛇毒的降压药物---Captopril(卡托普利），Enalaprilat (依那普利 )

一、去整合素(Disintegrins) 去整合素(Disintegrins)是一种低分子量富含 半胱氨酸的整合素结合肽（Cysteine peptide）， 具有不同的功能，如抑制细胞粘附（Cell adhesion）和增殖(Proliferation)。 大多数的去整合素（Disintegrins）都有以下基序 （Motif） 之一：RGD或KGD，也有一些具有MVD或RED基序。 大多数去整合素（Disintegrins）表现出 拮抗整合素 的活性，如 αIIbβ3、αvβ3和α5β1 ，其他整合素也会受到抑制。 去整合素( Disintegrins)不仅存在于 蛇毒（Snake venom）中，也存在于 嗜血寄生虫(Hematophagous parasite)的 排泄腺（Excretion glands）中。 

目前在临床中使用的三种αIIbβ3拮抗药物中，其中 依替巴肽（Eptifibatide）和替罗非班(Tirofiban)，是从蛇毒中提取的去整合素（Disintegrin），是低分子量的化合物。 Table 1 来自于不同物种的以αIIbβ3为靶向的去整合素  

二、不同物种来源的去整合素 1. 来源于 蛇类 的去整合素（Disintegrins from Snakes） 

1.1 Echistatin （ 蛇毒锯鳞蝰素 ）

Echistatin（5.4 kDa）是1988年首次从蛇毒中分离出来的一种多肽（49个氨基酸），通过4个二硫键稳定。

Echistatin包含RGD序列，使用固相结合方法（Solid-phase binding assays）测试了几种整合素的半最大结合浓度（Half-maximal binding concentration）：αvβ3（0.46 nM）、α5β1（0.57 nM）和αIIbβ3（0.90 nM）。因此，可以看出，Echistatin对αIIbβ3没有特异性。

Echistatin与阿昔单抗（Abciximab）在αIIbβ3上具有相同的结合位点，即都结合于β3亚基上的结合袋（Binding pocket）。

临床上批准的替罗非班(Tirofiban)就是源自于Echistatin。

1.2. Rhodostomin/Kistrin Rhodostomin/Kistrin（8.4 kDa）由68个氨基酸组成，由6个二硫键稳定。 Rhodostomin在 毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达， 并抑制CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞）粘附于纤维蛋白原（注：CHO细胞可表达αIIbβ3和αvβ3，IC50分别为21 nM和13 nM）。Rhodostomin还抑制K562细胞粘附于纤连蛋白（Fibronectin）(α5β1，IC50256 nM)。 

2.从 蜱 中分离的去整合素(Disintegrins from Ticks) 

2.1 Disagregin Disagregin（6.9 kDa）由60个氨基酸组成，由3个二硫键稳定。 

Disagregin是从 非洲钝缘蜱（ Tick ornithodoros moubata）中分离出来的，并抑制ADP刺激的血小板聚集。

Disagregin 阻断了血小板与纤维蛋白原的粘附，表明它是一种纤维蛋白原拮抗剂（Fibrinogen antagonist）。

Disagregin已经通过全化学合成(Total chemical synthesis)，并被证明能抑制血小板粘附、血栓形成和纤维蛋白形成。 

2.2 

Variabilin Variabilin（5kDa）由47个氨基酸组成，包含5个半胱氨酸(Cysteines)。

Variabilin从 变异革蜱 （Dermacentor variabilis，又称美洲狗蜱，狗矩头壁虱，美洲大革蜱，美国狗壁虱 ）分离得到，可以抑制ADP诱导的血小板聚集。 Variabilin还可 阻断αIIbβ3与纤维蛋白原的相互作用，以及阻断αvβ3与玻连蛋白的相互作用。 

3. 从 水蛭 中 分离的去整合素（Disintegrins from Leeches） 

3.1. Decorsin Decorsin（4.4kDa）由39个氨基酸组成，由3个二硫键稳定。 Decorsin是从 北美水蛭（Macrobdella decora，又称 北美巨蛭）中分离出来的，可以 阻断αIIbβ3与纤维蛋白原的相互作用，并抑制ADP诱导的血小板聚集。 

3.2. Ornatin E Ornatin E（5.7kDa）由50个氨基酸组成，由3个二硫键稳定。 Ornatin E类似于decorsin。它是从 水蛭(Placobdella ornate)中分离出来的，并 阻断αIIbβ3与纤维蛋白原的相互作用（IC50 4.4 nM），抑制ADP诱导的血小板聚集（IC50 438 nM）。 

Ornatin E也被重组表达(Recombinantly expressed)，与从水蛭中分离的Ornatin E相似的结果，只是 重组表达的Ornatin E 显示出更强的抑制ADP诱导的血小板聚集的能力（IC50 284 nM，更低）。 

4. 从 蠕虫 中分离的去整合素（Disintegrins from Worms) 钩虫血小板抑制剂（ Hookworm Platelet Inhibitors, HPI）（15 kDa），从 犬钩口线虫中分离而来。可以 抑制血小板的聚集，以及血小板粘附于纤维蛋白原（通过αIIbβ3介导）和胶原蛋白（通过α2β1介导）。 

5. 从 马蝇 中分离的去整合素（Disintegrins from Horseflies） 

5.1 Tabinhibitin

Tabinhibitin（15 kDa)是从中国特有的姚虻（Horsefly tabanus yao macquart )的唾液腺中分离而来的。

Tabinhibitin可通过αIIbβ3整合素受体阻断血小板的聚集，目前尚不清楚tabinhibitin是否能够作用于其他受体。

5.2 Tablysin-15

Tablysin-15 (26 kDa) 也是从 姚虻的唾液腺中分离出来的。Tablysin-15 的序列与Tabinhibitin同源。

Tablysin-15能阻止血小板聚集，并抑制血小板与纤维蛋白原（αIIbβ3）的粘附；阻止内皮细胞粘附于玻连蛋白（Vitronectin）(通过αvβ3 ）；阻止内皮细胞粘附于纤连蛋白（Fibronectin）(α5β1）。

三、总结

依替巴肽和替罗非班是基于配体模拟物（RGD-mimetics），以低亲和力与整合素结合，并诱导构象变化(Conformational change)，从而导致“由外向内”的信号传导和反常的血小板活化（Paradoxical platelet activation）。三种抑制剂的使用，导致出血风险增加，相对较少发生的是血小板减少症（Thrombocytopenia）。血小板减少症，是由抗体引起的免疫反应的结果。当整合素与抑制剂相互作用后，整合素受体会发生构象改变，暴露配体诱导结合位点（LIBS， Ligand-induced binding sites），抗体针对这个位点，介导免疫反应。

通常，使用阿昔单抗后血小板减少的发生更频繁，这是由于暴露了更多的表位（Epitopes），这些表位可以被已经存在于血液中的抗体识别。这些“配体模拟”效应可能不会被去整合素（Disintegrins）诱导，因为噬血寄生虫和蛇的去整合素通常在被宿主免疫系统调理时，具有屏蔽表面成分（Shielding surface components)。它们也可以改变表面以逃离宿主的识别。可以推测，去整合素已经进化成能够逃离人类免疫系统的形式。之前的一项研究发现了一种不引起αIIbβ3构象改变的去整合素，可导致抗血小板活性，而不会引起出血。对去整合素的更多研究，包括结构-活性关系，可能进一步了解其生物活性和血小板抑制机制。

（完）

【参考文献】

1. van den Kerkhof D L, van der Meijden P E J, Hackeng T M, et al. Exogenous Integrin αIIbβ3 Inhibitors Revisited: Past, Present and Future Applications[J]. International journal of molecular sciences, 2021, 22(7): 3366.