浓缩细菌DNA方法助力败血症早期诊断

血液培养是鉴别造成败血症的细菌的常用方法。而PCR试验需要从血液样品中提取细菌DNA，这样往往会延误及时应用抗生素的时机，同时血液中存在的多种人体DNA也可能对PCR检测带来干扰。今天金宝就给您介绍一种有助于克服上述困难的新方法。

研究者通过连续稀释加入到假败血症血液样品中的大肠杆菌，开发了一种结合了极性清洁溶剂和基础PH调整的简单方法来去除血液样本中的人类DNA。

具体方法是：在液体LB培养基中加入大肠杆菌DH5α菌株  （新加坡英杰公司）  进行增殖直到达到对数生长期。从10000CFU/ml到1CFU/ml连续稀释直到最后呈阴性，添加该细菌到5ml人血中。接着使用添加到人血中的细菌进行DNA去除程序并随后分离细菌DNA。取200μl包含25mMTris-EDTA、100ng/μl人体全血中提取的DNA、pH为8的溶液，在这样的溶液中重构从克雷伯氏肺炎菌、奇异变形杆菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、猪丹毒杆菌和肠球菌单个菌落中分离的DNA，使用5ml上述溶液作为所有PCR或实时PCR的阳性质控品。 筛检一些包含非离子  （NP-40，Triton-X100）  、离子  （CTAB，SDS）  和两性离子的清洗剂。

只有Triton-X 100裂解哺乳动物细胞膜，但不会裂解大肠杆菌。因此Triton-X 100留作进一步分析。不同的条件如pH变化、时间变化和Na2Co2浓度的变化被优化。使用哺乳动物细胞裂解缓冲液MCLB-1混合包含1.2ml溶剂的1.2ml健康献血者血液来处理假败血症样品  （添加100000大肠杆菌细胞）  。

溶剂处理后，离心悬浮液收集后续NaOH/SDS总DNA提取用的细菌小球。通过RT-PCR检查并定量人体DNA残存物和添加的大肠杆菌基因组。经过一夜的培养后，将大肠杆菌添加到来自健康献血者的外周静脉血样品中建立稀释序列，稀释序列从1000CFU/ml、100CFU/ml、10CFU/ml到0CFU/ml  （阴性质控品）  。 稀释序列分为2组。

第一组在室温下彻底与等量哺乳动物细胞裂解缓冲液  （包含2M Na2CO2，pH9.8，1%Triton-X 100的MCLB-1）  混合3分钟去除人体DNA，完全破碎的人体染色质混入DNA片段。培养步骤结束后，添加等量的中和缓冲液  （1M Tris-HCl，pH4.5）  避免进一步细胞裂解。以5000g离心样品5分钟。去除上清液，在200μl的1x磷酸盐缓冲盐水  （PBS）  中复苏细菌小球，通过常规方法利用NaOH/SDS分离细菌DNA。

通过大肠杆菌特异引物/探针实时PCR或基于实时PCR，利用β球蛋白特异引物：betaF：5’-AGA AGA GCC AAG GAC AGG TAC G-3’, BetaR：5’-TGC TAG TGA ACA CAG TTG TGT CAG A-3’检测是否残余人体DNA和添加的大肠杆菌基因组DNA的完整性。 

在金宝看来，这个简单而直接的方法可以去除败血症患者外周血中98%的人体DNA，实时PCR的检测限可以提高到10大肠杆菌 CFU/ml，灵敏度是传统的实时PCR试验的10倍以上，能显著提高败血症的诊断率。  这样十分有助于败血症患者及早选用敏感的抗生素治疗，对于预后的改善有显著意义。  

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原文发布时间 | 2019年01月29日