精准前沿丨基于cfDNA片段谱特征推断基因的表达

本期《精准前沿》栏目分享斯坦福大学医学院Alizadeh及Diehn两个研究团队合作发表在Nature Biotechnology（IF=68.164）上的一篇研究[1]，研究开发了一种利用cfDNA片段特征对基因表达进行无创推断的方法（EPIC-seq）。

研究背景

  血浆中的cfDNA（cell-free DNA）是由身体各个组织的细胞凋亡后释放的片段化DNA混合物。在肿瘤患者中，随着肿瘤细胞的生长，癌细胞的遗传物质会释放到血液中，因此cfDNA是一种有效的对癌症进行无创检测的biomarker，有助于探寻其组织起源、组织损伤以及肿瘤类型。目前的cfDNA检测方法主要是对胚系或体细胞突变、及染色体异常的检测，在肿瘤基因分型、肿瘤突变负荷、以及无创产前筛查等检测中很高的应用价值。然而，ctDNA（circulating tumor DNA）在cfDNA中的占比是较低的，而且即使在肿瘤突变负荷高的癌症中，甚至在疾病负担高的患者中，大多数癌症来源的cfDNA片段都是未突变的。因此，利用表观遗传学特征对cfDNA片段进行解读是非常有必要的；应用场景包括：未发生遗传突变的组织损伤的检测，以及对癌症进行分类。此外，目前研究的cfDNA片段化组特征包括片段大小、测序深度、末端基序频率、转录起始区域的核小体位置等；尽管如此，这些方法并未有实现单基因水平下推断基因表达的分辨率。为解决这些局限性，本研究中通过对目标区域的深度测序，以高分辨率分析目标区域cfDNA的片段特征，并实现对单个基因表达水平的预测。  

研究设计

提出假设

静息态的启动子区域（低表达）由于染色质呈现关闭状态，受到核小体的保护而免遭多种内切酶的剪切；而活跃状态下的启动子区域（高表达）的染色质呈现开放状态，被随机剪切的可能性更高；因此，活跃状态的启动子区域的cfDNA片段将表现出更随机的裂解模式，即会产生更多种类的DNA片段长度。  

研究目的

1）发现能够预测基因表达的cfDNA片段特征矩阵；2）构建一个能从cfDNA推断基因表达的统计模型；3）通过预测的表达值对癌症亚型分类；4）对癌症进行检测。  

首先，为了发现能够预测基因表达的cfDNA片段特征，作者需要首先验证假设是否正确，分别采集cfDNA的片段组学特征以及基因表达水平对假设进行初步探索。作者采集了来源未知且ctDNA浓度小于0.05%的恶性肿瘤病人样本，进行了深度WGS测序，测序深度约250X，从而获得cfDNA的片段特征；对血液白细胞进行RNA-seq测序得到基因表达水平的结果；分析两者间的关系，结果如下图1b所示，纵坐标是根据基因的表达水平对其进行排序，越往上启动子处表达水平越高，横坐标是启动子处的cfDNA片段大小。可以发现，表达水平越高时，单个核小体长度的片段越少，即151-210 bp这个区间；而小于单核或小于双核长度（100-150，以及211-300 bp）的片段多。这个结果支持作者的假设，定位到高表达基因TSS两侧约2-kb区域的cfDNA分子比定位到低表达基因TSS的片段表现出更多的片段长度多样性。这种现象在亚核小体片段中尤其突出（<150个碱基对（bp）和210–300 bp）。

为了评估这一发现的稳健性，对健康样本的cfDNA进行深度WGS测序；并利用已发表的公共数据对40例健康和46例肺腺癌(LUAD)样本的cfDNA WGS结果进行分析，证明了已知的肺癌特异性生物学标签能通过cfDNA进行识别。最后，进行扩展验证，评估在全外显子测序中是否能发现一致的cfDNA特征，因此作者采集了11位小细胞肺癌患者样本和28位健康志愿者样本，并进行深度全外显子测序。作者发现，游离DNA的指征与肺癌患者肿瘤细胞基本类似。因此，可以说cfDNA片段多样性特征可以在基因水平上反应肿瘤组织的信息。cfDNA片段多样性通过信息熵进行度量，计算单个基因TSS向两侧各延展1kb范围内的cfDNA片段长度的熵，然后基于多项式概率分布模型对熵进行归一化，得到promoter fragmentation entropy(PEE)值，作为该研究中的cfDNA的片段特征。

然后构建一个能从cfDNA推断基因表达的统计模型，提出EPIC-seq方法通过预测的表达值构建分类模型。EPIC-seq是基于对cfDNA中TSS侧翼区域的定向捕获深度测序，并结合用机器学习预测RNA表达的一种方法。整体工作流程包括从血浆中提取cfDNA、文库制备和感兴趣基因的TSS区域捕获、对富集区域的高通量测序，最后是cfDNA片段分析，然后构建机器学习模型计算表达预测值以及对样本进行分类。作者应用EPIC-seq对非小细胞肺癌（NSCLC）的组织学进行分类，区分弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的分子亚型，评估免疫治疗反应，并评估单个基因的预后价值。

研究结果

1. 确定与基因表达相关的cfDNA特征

PFE（启动子片段熵）推测的基因表达水平与TSS的相对位置息息相关。通过对NSCLC肿瘤患者的分析发现，基于在肿瘤中高表达的基因计算的PFE会随着肿瘤的进展值会增加；而在低表达基因中未发现这种现象，说明PFE特征具有基因和组织特异性。

测序深度越高，PFE和NDR（核小体枯竭区域）作为特征与基因表达水平间的相关性越高。

上述这些结果都说明DNA片段特征都与基因表达水平具有强相关性，PFE较之前发表的cfDNA特征其相关性最高。

图1. cfDNA分子特征与基因表达之间的关系

2. 与基因结构相关的PFE与表达之间的关系

为了进一步探索基因表达与片段熵之间的关系，分析在不同TSS距离以及不同基因结构body中两者之间的关系。a：发现离TSS越近熵值越大，在高表达基因中越显著；b：在TSS 2 kb范围内能发现片段熵值呈现双峰分布，能对表达水平进行更好的区分，离TSS越近双峰波动越大；c：第一个外显子的结果与TSS结果类似，随着距离TSS越远，信号越来越弱，结果说明在转录组中TSS附近区域的cfDNA片段化特征与基因表达水平高度相关。因此，进一步验证，在超深度WES下，cfDNA片段熵值在实体瘤中对基因表达的推断情况，并将结果与RNA-seq分析的结果进行比较。d/e：发现在RNA-seq肿瘤样本中高表达的基因，在cfDNA PFE结果中肿瘤患者也高于健康对照；低表达时趋势也一致；f：通过cfDNA的PFE特征得到的肿瘤相关基因以及健康对照相关基因；g/h：展示的是f得到的差异基因，在RNA-seq的结果中表现一致，cfDNA高表达的基因在RNA-seq中显著高表达，相反也是一样的。因此以基因水平为分辨率，从cfDNA推断基因的表达水平是可行的，并且能够捕获肿瘤特异的表达信息。

图2. 与基因结构相关的片段大小熵为WES cfDNA图谱的表达推断提供信息

3. 与基因结构相关的PFE与表达之间的关系

EPIC-seq对NSCLC进行肿瘤检测。在肿瘤检测中，作者通过67例（stage II期7例，III期30例，IV期30例）非小细胞肺癌患者和71例健康样本数据进行训练，对20位NSCLC患者和23位健康样本进行预测，得到了较好的分类性能，验证集的AUC为0.83。分别统计不同分期肿瘤的预测性能，该方法对I期患者的分类效果不好，疾病进展程度越深，分类性能越好；不同肿瘤浓度对95%特异性下分类敏感性的影响；EPIC-seq分类性能与肿瘤浓度显著相关，肿瘤浓度越高，灵敏度越好；EPIC-seq可用于对NSCLC（LUAD 36例& LUSC 31例）进行组织分型，能获得较好的分类性能，AUC为0.9。

评估EPIC-seq是否可用于预测预后，分别在免疫检查点抑制剂开始治疗时以及治疗4周后分别进行EPIC-seq，并计算dynamic score；发现EPIC-seq可有效区分持续性获益的人群以及无持续性临床获益人群；对EPIC-seq动力学分数按照中位数划分成两组，治疗后分值降低的组较分值升高的组获得了更好的治疗效果。

图3. 应用EPIC-seq对肺癌进行检测并进行组织学分类  

讨论  

EPIC-seq检测对ctDNA浓度敏感，检测早期癌症的敏感性会降低。此外，该方法推断RNA转录模式的能力究竟如何仍未知，因此其在诊断不明的病人中推断癌症类型的能力目前还不清楚。  

结语  

在本研究中，EPIC-seq方法是一种利用cfDNA片段特征对基因表达进行无创推断的方法，可用于多种临床应用，包括肿瘤检测、分型、预后预测、治疗检测等。与EPIC-seq相比，先前发表的基于cfDNA片段技术和特征的方法，都不能高性能的实现对单个基因表达水平的预测。本文描述的方法使用PFE作为指标，以及通过靶向捕获感兴趣基因的启动子区域，实现了更高的测序深度，从而显著提高了分类和预测的性能。 END 

参考文献：  

[1]    Esfahani, M.S., Hamilton, E.G., Mehrmohamadi, M. et al. Inferring gene expression from cell-free DNA fragmentation profiles. Nat Biotechnol 40, 585–597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01222-4  

撰写丨吴兮  

编辑、排版丨SX