组氨酸磷酸化修饰的前世今生

前   言   

蛋白磷酸化修饰是一种可逆的翻译后修饰过程。在20种天然氨基酸中，有9种可以发生磷酸化修饰，但人们目前研究最多的还是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化修饰，而对于组氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的磷酸化修饰知之甚少，称为 非经典磷酸化 。60年前，人们第一次在线粒体酶的中间体上发现了磷酸化组氨酸（pHis），之后陆续发现了组氨酸激酶和磷酸酶，并证实了 组氨酸的磷酸化修饰以可逆的方式调控蛋白质功能 。p-His因其 化学不稳定性 的特点而使人们不易对其展开研究。然而，近年来，随着pHis研究技术的不断发展，人们已经发现了p-His的多种功能，找到了许多含有pHis的蛋白质分子，并揭示了pHis在参与细胞生命过程中的重要角色。 2022年6月16日，Molecular Cell在线发表了美国索尔克生物研究所的 Tony Hunter 教授的题为“ A journey from phosphotyrosine to phosphohistidine and beyond ”的前沿文章，总结了对组氨酸磷酸化修饰研究过去、目前的成就及未来的展望。

作者 | 三横一竖

1930年，Phoebus Levene教授在研究卵黄蛋白时提出了Tyr可能存在磷酸化修饰。此后的40年间，酪氨酸磷酸化修饰的研究方兴未艾，这主要是得益于其化学性质的稳定，可以通过32P同位素标记法研究，此外，特异性pTyr抗体的出现大大降低了人们对其研究的门槛。有趣的是，人们在使用一种pTyr mAb研究ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）的pTyr时，意外地发现了ACLY上也存在pHis。

根据磷酸基团连接His咪唑环N原子的不同， pHis分为1-pHis和3-pHis 。1962年，Paul Boyer教授首次在线粒体琥珀酰CoA合成酶（SCS）上发现pHis的存在，后来证实这是一种3-pHis。pHis参与SCS的催化过程： succinyl CoA + Pi + NDP = succinate + CoA + NTP ，是TCA循环的关键环节。之后，人们在其他几种代谢酶上也发现了pHis，甚至出现在细菌双组分信号转导系统的组氨酸激酶关键活性位点上。

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图 1、蛋白中组氨酸残基磷酸化与去磷酸化的机制

与pTyr/pSer/pThr的磷酸酯键相比，pHis的P-N水解自由能更高，更易以离去基团的角色作为磷酸基团供体，提示pHis可能参与细胞机制的调控。此外，pHis因其P-N键的热力学不稳定性，具有对热和酸不稳定的特点，这决定了不能用研究经典磷酸化的方法研究。人们研发出特异性针对p-His 的抗体，使得pHis的研究门槛大大降低。同时，富集并分析pHis蛋白和肽段的新方法也不断问世。

图2、组氨酸磷酸化研究的关键时间节点

01 pHis蛋白组学研究

Potel等使用固定修饰Fe2+离子亲和色谱（IMAC）磷酸肽段富集方法发现E.coli的磷酸蛋白质组中含有246个pHis位点，占已知磷酸化位点的12%。在一项斑马鱼幼虫的研究中，研究人员使用传统TiO2磷酸肽段富集法发现了68个pHis位点，占已知磷酸化位点的6.3%。Eyers团队发明了一种对酸不稳定、非经典磷酸肽段的富集方法，称为UPAX法，其是利用pH 6.8下强大的阴离子交换色谱以保证经典、非经典磷酸化位点的全谱。利用UPAX法，他们发现HeLa细胞的磷酸蛋白组中约30%的磷酸化位点是由非经典磷酸化位点组成的，并发现了83个pHis位点。为了更好地整合这些蛋白组学数据，人们在2021年建立了一个在线pHis位点数据库，HisPhosSite [5]（图3），它也具有预测原核生物和真核生物中pHis的功能。

图3、HisPhosSite数据库介绍

02 组氨酸激酶的研究

在哺乳动物细胞中不断发展的pHis蛋白组学带来一个有趣的问题，即哪些组氨酸激酶负责磷酸化这些蛋白呢？截至目前，唯一一类确证的His激酶类是核苷二磷酸激酶中的NME激酶家族蛋白，包括NME1、NME2。NME蛋白是一类管家蛋白，可以将具有1-pHis的酶中间体上的磷酸基团转移给NDP，以生成NTP。同时，NME蛋白还可以将活性位点上的磷酸基团转移给底物蛋白的His残基上，发挥His激酶的作用。然而，这一发现仅仅是在非细胞水平得到了证实，目前还没有细胞内的直接证据报道。

03 组氨酸磷酸酶的研究

迄今为止，人们已经发现三种蛋白具有pHis磷酸酶（PHPs）的作用，分别是PHPT1、PGAM5和LHPP。其中，PGAM5既是PHPs，同时也是pSer/pThr磷酸酶，后者通过一个pHis中间体发挥去磷酸化功能。

04 组氨酸磷酸化在细胞调控机制中的研究

越来越多的证据提示组氨酸磷酸化参与了蛋白功能的调控。比如，NME2介导的磷酸化可以调控离子通道的活性。G蛋白受体信号也受到His磷酸化的调控。NME2与异源三聚体G蛋白的βγ亚基相关，可以使其β亚基上的His266磷酸化，pHis266将磷酸基团转移给GDP以产生GTP，导致G蛋白活化和腺苷环化酶活化。

此外， pHis广泛参与了细胞的细胞周期进展、信号转导以及RNA剪切过程。一项pHis位点基因本体分析显示，His磷酸化修饰在神经母细胞瘤[6]中参与了细胞糖酵解、黏着斑形成与迁移、激酶信号通路、蛋白质翻译过程（图4），在HeLa细胞中参与了大分子代谢过程、微管蛋白功能、RNA加工和剪切过程等。

图4、His磷酸化修饰对神经母细胞瘤的功能调控

结  语

近年来，His磷酸化修饰在癌症中的作用逐渐受到人们的关注。有研究指出，NME1/nm23 His激酶可能是黑色素瘤和乳腺癌的一种潜在的抗转移蛋白，而在前列腺癌和卵巢癌中促进肿瘤转移，因此亟需确证NME1在肿瘤转移过程中的作用及具体机制。此外，有研究报道His磷酸化促进肿瘤发生过程。因此，发现调控这些癌基因功能的pHis蛋白迫在眉睫。

[1]Hunter T. A journey from phosphotyrosine to phosphohistidine and beyond. Mol Cell. 2022 Jun 16;82(12):2190-2200.

[2] Frackelton, A.R., Jr., Ross, A.H., and Eisen, H.N. (1983). Characterization and use of monoclonal antibodies for isolation of phosphotyrosyl proteins from retrovirus-transformed cells and growth factor-stimulated cells. Mol. Cell.Biol. 3, 1343–1352.

[3] Besant, P.G., Tan, E., and Attwood, P.V. (2003). Mammalian protein histidine kinases. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 35, 297–309.

[4]Jung, H., Shin, S.H., and Kee, J.M. (2019). Recent updates on protein N-phosphoramidate hydrolases. ChemBioChem 20, 623–633.

[5] Zhao J, Zou L, Li Y, Liu X, Zeng C, Xu C, Jiang B, Guo X, Song X. HisPhosSite: A comprehensive database of histidine phosphorylated proteins and sites. J Proteomics. 2021 Jul 15;243:104262.

[6]Adam, K., Lesperance, J., Hunter, T., and Zage, P.E. (2020). The potential functional roles of NME1 histidine kinase activity in neuroblastoma pathogen_esis. Int. J. Mol. Sci. 21, 3319–3337.

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