中科院深圳先进院马英新团队开发新冠S蛋白检测的比率荧光免疫新方法

近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所 马英新 课题组在国际学术期刊 Sensors and Actuators B: Chemical 上发表了题为： Construction of ratiometric Si-Mn:ZnSe nanoparticles for the immunoassay of SARS-CoV-2 spike protein 的研究论文。

该研究开发了一种比率型荧光探针 （Si-Mn:ZnSe NPs） ，通过结合酶联免疫反应 （ELISA） 模型，建立了一种新冠病毒 （SARS-CoV-2） 刺突蛋白 （S蛋白） 的免疫荧光检测方法。

以SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒作为实际样本考察该方法的传感性能，结果显示该方法对SARS-CoV-2假病毒响应特异性良好，具有与商品化试剂盒相当的检测灵敏度，为诊断SARS-CoV-2感染提供了一种可靠的潜在思路。

S蛋白是新冠病毒侵染过程中的关键成分，具有识别目标细胞和促进膜融合的作用。因此，快速检测S蛋白对新冠疫情的防控至关重要。

图1：SARS-CoV-2表面的S蛋白（Acta Pharmacol Sin 2020, 41, 1141-1149，）

目前，新冠感染早期诊断的主流方法有三种，包括分子检测 （检测病毒RNA） 、抗体检测 （检测IgG和IgM抗体） 和抗原检测 （检测病毒蛋白） 。相比其他两种方法，抗原检测特异性好且反应时间短，在大批量SARS-CoV-2阳性筛查中，已得到广泛应用。当下市场上的抗原自测试剂盒多数依托胶体金免疫测流层析技术，灵敏度低限制了其应用场景。

量子点 （QDs） 具有吸收光谱宽、斯托克斯位移大、荧光强度高和生物毒性低的优势，是一类理想的荧光探针，在生化分析领域得到广泛应用。据研究，荧光法的灵敏度是比色法的10~100倍，荧光免疫分析有望提升病毒抗原检测的灵敏度。本研究构建的比率荧光法采用Si-Mn:ZnSe NPs双发射探针，相当于在检测系统中添加了一项内标校准，解决了单发射探针强度受环境变化、探针浓度变化和仪器波动的影响较大的局限性，具有灵敏度高、稳定性好的优点。

图2：（A）Si-Mn:ZnSe NPs探针构建；（B）比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2 S蛋白原理。通过形成固定化CAT的免疫复合物，可将检测S蛋白含量转化为检测体系内H2O2含量。

根据上述原理图，该团队通过Si dots和Mn:ZnSe QDs的自组装作用制备了Si-Mn:ZnSe NPs探针。首先考察了Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度对H2O2浓度的响应。随着H2O2浓度从0μmol/L增加到50μmol/L, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光被明显猝灭，而440nm处的荧光没有明显变化。这证明通过比率荧光的方法检测体系中的H2O2浓度是可行的 （图3） 。过氧化氢酶 （CAT） 可以催化H 2 O 2 分解，因此，CAT介导的ELISA可以用于S蛋白的免疫分析。

图3：Si-Mn:ZnSe NPs对H2O2响应的荧光光谱

在最优反应条件下，S蛋白浓度与Si-Mn:ZnSe NPs的荧光强度比呈线性关系。如图4A和4B所示，随着S蛋白浓度从0.05ng/mL增加到300ng/mL, Si-Mn:ZnSe NPs在610nm处的荧光发射强度逐渐增强。如图4C所示，lg（S）与荧光信号比（F610/F440）在0.05~10ng/mL范围内呈良好线性关系 （y = 0.2318x + 0.3378, R2 = 0.9904） 。图4D显示，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）在5~50ng/mL范围内呈良好线性关系 （y = 0.0116x + 0.4479, R2 = 0.9987） 。本方法对S蛋白检出限为0.032ng/mL。

图4：不同浓度SARS-CoV-2 S蛋白存在下Si-Mn:ZnSe NPs的荧光光谱（A）与信号比（B）；SARS-CoV-2 S蛋白浓度与荧光信号比的线性拟合（C-D）

前期工作中，该团队将SARS-CoV-2 S蛋白整合到HIV假病毒合成系统中，构建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒 （ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 13, 21, 24477-24486.） 。

本研究以上述SARS-CoV-2 S蛋白假病毒作为实际样本模型考察了本方法的准确性与重现性，并与商品化试剂盒检测结果进行对比 （图5） 。结果显示，所建比率荧光ELISA法测定的S蛋白浓度与商品化试剂盒相似，表明该方法具有较高准确性。构建VSV-G假病毒作为阴性对照，采用比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒中的S蛋白，结果如图6所示，10组SARS-CoV-2假病毒均有检出，而10组VSV-G假病毒均无检出，表明该方法对SARS-CoV-2 S蛋白检测具有较高的特异性。

图5：商品化试剂盒和本方法测定SARS-CoV-2假病毒S蛋白的结果。n.s.表示不显著，*表示p＜0.05。

图6：比率荧光ELISA法检测SARS-CoV-2假病毒和VSV-G假病毒S蛋白的结果

本研究以水热法制备了Si dots，水浴法制备了Mn:ZnSe QDs，通过二者静电相互作用自组装合成具有良好pH稳定性和光稳定性的Si-Mn:ZnSe NPs。H 2 O 2 可以特异性猝灭探针位于610nm处的荧光而对440 nm处的荧光无影响。在ELISA体系中，通过固定化CAT免疫复合物巧妙地将检测S蛋白浓度转化为检测体系内H2O2浓度。结果显示，在0.05~10ng/mL和5~50ng/mL浓度范围内，S蛋白浓度与荧光信号比（F610/F440）呈良好线性关系，检出限为0.032ng/mL。构建SARS-CoV-2假病毒作为实际样本模型，所构建方法的检测结果与商品化试剂盒相当。综上，所构建的比率荧光ELISA方法对SARS-CoV-2 S蛋白具有较高准确性和特异性，可作为一种新型诊断方法协助病毒感染筛查。

马英新 副研究员为本文通讯作者，毛国斌副研究员与研究助理李艺芳为论文共同第一作者，团队其他成员及合作者均为本研究做出了重要贡献。该项目得到了国家重点研发计划项目，国家自然科学基金项目，中国科学院青年创新促进会，广东省自然科学基金项目，广东省合成基因组学重点实验室等项目的资助。

论文链接 ：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400522009480

PI与课题组简介

马英新 博士，中国科学院深圳先进技术研究院副研究员，国家重点研发计划青年首席科学家，博士生导师，近5年主持国家重点研发计划青年项目、国家自然科学基金青年项目、广东省杰出青年基金项目、深圳市优秀科技创新人才培养项目、中科院深圳先进院优青项目和博士后科学基金面上项目，并获批了中国科学院青年创新促进会、深圳市高层次人才、博士后创新人才支持计划等人才计划。以第一/通讯作者身份在 J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、ACS Nano、Sci. China-Life Sci.、Anal. Chem.、ACS Appl. Mater. Interfaces 等国际著名杂志发表论文20余篇。

实验室主要研究方向是假病毒平台的构建及应用、单病毒标记与示踪、病毒的药物筛选及疫苗研发；新型电化学/荧光探针技术的开发、病毒高灵敏检测方法的开发。

课题组长期面向1）假病毒平台的构建及应用、单病毒标记与示踪、病毒的药物筛选及疫苗研发，2）新型电化学/荧光探针技术的开发、病毒高灵敏检测方法的开发方向招聘博士后和研究助理，有意申请者请将个人简历（要求为PDF）以邮件方式发送至： yx.ma1@siat.ac.cn 。

实验室主页：http://isynbio.siat.ac.cn/Malab/

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