肠道中双歧杆菌益生菌干酪乳酪杆菌张反应在不同受试者间存在差异

导读  

双歧杆菌对人类肠道健康具有促进作用，但肠道中双歧杆菌的确切种类水平组成及其对益生菌干预的反应尚未充分探讨。本研究招募了来自亚洲6个不同地区（新加坡、印度尼西亚、新疆、甘肃、内蒙古和蒙古）的104名志愿者。观察各组肠道菌群及其对干酪乳酪杆菌张（LCZ）干预的反应（第0、7和14天；停止益生菌摄入14天后），LCZ干预后观察到区域差异反应。本研究利用双歧杆菌特异性引物PacBio分子实时测序（SMRT）进一步研究了肠道双歧杆菌物种水平的变化。首先，本研究发现青春双歧杆菌（42.58%）和短双歧杆菌（26.34%）是6个亚洲地区的核心种。其次，益生菌诱导的肠道双歧杆菌菌群变化的主坐标分析（以加权UniFrac距离表示）将6个区域分为2个集群，即北部（新疆、甘肃、内蒙古和蒙古）和南部（新加坡、印度尼西亚）地区。第三，LCZ干预引起肠道双歧杆菌菌群区域差异反应。在LCZ干预后，北部地区动物双歧杆菌的相对丰度明显增加，而南部地区则没有。此外，LCZ干预后7天，南部受试者的加权UniFrac距离显著增加，而北方受试者的加权UniFrac距离没有增加。在北部地区，肠道青春双歧杆菌与基线肠道双歧杆菌菌群的加权UniFrac距离显著负相关，表明LCZ可能对北部受试者的肠道双歧杆菌菌群有稳态效应。总的来说，研究发现益生菌诱导的肠道双歧杆菌菌群反应随受试者的地理来源而变化，而青春双歧杆菌可能在维持肠道双歧杆菌菌群的整体稳定性中发挥作用。

论文ID

原名：Gut Bifidobacterium responses to probiotic Lactobacillus casei Zhang administration vary between subjects from different geographic regions

译名：肠道中双歧杆菌对益生菌干酪乳酪杆菌张的反应在不同地域的受试者间存在差异

期刊：Applied Microbiology and Biotechnology

IF：5.560

发表时间：2022.3.23

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点试验室

DOI号：10.1007/s00253-022-11868-4

实验设计

本研究招募了来自亚洲6个不同地区的104名健康成年人，包括印度尼西亚（雅加达，n=23）、新加坡（新加坡，n=21）、蒙古（乌兰巴托，n=12）、内蒙古（呼和浩特，n=16 ）、新疆（乌鲁木齐，n=22）和甘肃（甘南藏族自治州，n=12）。所有参与者每日给予含LCZ的益生菌补充剂2g（0.5×1010CFU/g/d）。连续14天在午餐后1小时内食用益生菌。在第0天（益生菌摄入第1天）、第7天和第14天（分别连续摄入LCZ 7天和14天）和第28天（停止摄入LCZ后2周）收集粪便样本。使用QIAGENDNA粪便试剂盒从粪便样本中提取基因组DNA。提取的粪便宏基因组DNA用双歧杆菌特异性测序引物对Bif-6（5′-GGTAAGAGTCGGACGCTGTGCAATA A-3′，5′-GAAAGAAGAAGGCCACCAAGTA-3′）进行扩增。最后，使用PacBio SMRT II机器对构建的文库进行测序。对生成的数据进行生物信息学和统计学分析。

图1 实验设计图。

前言

肠道菌群与人体健康密切相关。在肠道菌群的其他成员中，许多双歧杆菌（放线菌门）被认为是无处不在的人类胃肠道居民。双歧杆菌是在婴儿肠道中建立第一个微生物群落的关键共生微生物。断奶后儿童和老年人肠道双歧杆菌的相对丰度显著降低，但在成年期保持相对稳定。与健康人相比，患有胃肠道疾病或疾病患者中存在的肠道双歧杆菌明显较少。此外，肠道双歧杆菌的多样性随着年龄和生命阶段的变化而变化。研究已经也发现成人中的双歧杆菌种群似乎更复杂。这可能意味着某些双歧杆菌通过宿主-微生物相互作用和/或它们与肠道菌群的相互作用来促进肠道和肠道菌群的稳态。

肠道双歧杆菌丰度相对较低，这使得很难检测和跟踪这类细菌；因此，它们在人类肠道中的确切成分一直存在争议。干酪乳酪杆菌张（LCZ）最初是从中国内蒙古的马奶酒中分离出来的。此菌株已被证明具有许多有益的效果。我们最近比较了LCZ对来自蒙古、新加坡、印度尼西亚和中国等四个亚洲国家的6个不同地区的104名健康成年人的肠道菌群的影响（甘肃、新疆、内蒙古）。本研究使用肠道菌群变异指数来定量比较LCZ对人体肠道微生态的影响，并观察受试者地理区域的不同影响。总的来说，LCZ的摄入促进了肠道有益类群（如乳杆菌，罗氏菌属，粪球菌属，直肠真杆菌）的增加，并增加了肠道中乳酸菌的数量。结果表明，摄入LCZ对健康成人肠道菌群有良好的调节作用。然而，该研究未能描述双歧杆菌菌群的变化，因为其在肠道中的相对丰度较低。鉴于肠道双歧杆菌的关键和有益作用，本研究扩展了我们之前的工作，旨在分析6个地区招募的健康成人肠道双歧杆菌，并调查肠道双歧杆菌在LCZ干预后的反应。为提高分类分辨率，采用双歧杆菌特异性引物单分子实时测序（SMRT）技术对双歧杆菌菌群进行分析。

实验结果

1 人口统计数据

对104名健康成年人的肠道双歧杆菌菌群（在4个不同的时间点，即第0、7、14和28天）进行分析。所有受试者从出生起就居住在采样区域，包括62名女性和42名男性，年龄22.29±2.69岁，体重指数（BMI，kg/m2）为22.33±2.89。这些受试者来自6个不同的亚洲地区，包括呼和浩特（16）、乌鲁木齐（22）、甘南藏族自治州（12）、乌兰巴托（12）、新加坡（19）和雅加达（23）（图2A）。受试者的信息汇总在补充表S1中。

图2 亚洲不同地区肠道双歧杆菌菌群组成的基线水平。A样本采集区域。饼状图显示了每个地区的优势双歧杆菌种类。B箱线图显示了每个地区双歧杆菌种类的相对丰度。C每个个体中双歧杆菌种类的分布。（原文图1）

2 肠道双歧杆菌菌群的序列覆盖

对由Bif-6引物生成的双歧杆菌扩增物进行测序，并按照我们前期的研究对原始序列进行生物信息学处理。经过质量控制后，在416份粪便样本数据集中（4个不同时间点的104个个体）保留了807132份高质量的双歧杆菌reads，用于下游分析。每个样本的平均读数为1940.22±790.16（补充表S2）。随着测序的进行，观测到的OTUs数量增加（补充图S1A），但其Shannon多样性指数曲线趋于平坦（补充图S1B），这表明测序深度足以捕获一个具有代表性的双歧杆菌菌群。尽管6个区域的志愿者数量不均匀，但根据样本量和观察到的物种数量进行的稀疏分析结果（补充图S2）证实，所采用的测序深度足够捕捉到每个组的大部分双歧杆菌多样性。

3 基线水平肠道双歧杆菌菌群的特征

分析第0天肠道双歧杆菌的组成。共检出27种，其中平均相对丰度在1%以上的有5种，分别为青春双歧杆菌（42.58%）、短双歧杆菌（26.34%）、链状双歧杆菌（17.04%）、两歧双歧杆菌（11.25%）、角双歧杆菌（1.46%）（图2B）。尽管优势双歧杆菌在不同地区和个体之间的分布有所不同（图2A），但在所有样本中都检测到了两个物种，即青春期双歧杆菌和短双歧杆菌（图2C）。

Shannon多样性指数（图3A）和观察到的物种数量（图3B）表明，新加坡和甘肃的肠道双歧杆菌菌群alpha多样性总体上低于其他地区。PCoA的结果显示，来自北部地区（包括内蒙古、蒙古、新疆和甘肃）的样本聚集在得分图的上象限，而代表南部地区（印度尼西亚和新加坡）的样本主要位于下象限（图3C），揭示了亚洲地区南北部肠道双歧杆菌菌群结构的明显差异。此外，北部地区的总体alpha多样性显著高于南部地区（图3D）。北部地区的青春双歧杆菌和链状双歧杆菌平均相对丰度高于南部地区，而短双歧杆菌和两歧双歧杆菌则趋势相反。此外，角双歧杆菌主要来自于北部地区的部分参与者中（图3E）。南北区有6种差异显著的双歧杆菌（P<0.05）；在北部地区角双歧杆菌、动物双歧杆菌、链状双歧杆菌和长双歧杆菌明显增多，而在南部地区两歧双歧杆菌和鸡双歧杆菌明显增多（图3F）。

图3 第0天肠道双歧杆菌菌群的变化。在益生菌干预过程中，六个地区受试者肠道双歧杆菌菌群Shannon多样性指数（A）和观察到的种类数（B）的变化。南北两组肠道双歧杆菌菌群UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）评分图（C）。Shannon多样性指数和南部类群间观察到的物种数量差异（D）。来自亚洲南部和北部地区受试者的肠道双歧杆菌菌群组成（E）。来自亚洲南部和北部地区的志愿者肠道中差异显著的丰富双歧杆菌种类（F）。北部代表亚洲北部地区，包括内蒙古、蒙古、新疆和甘肃；南部表示亚洲南部地区，包括印度尼西亚和新加坡。分别提供了显著不同对的P值。（原文图2）

4 LCZ对南北方地区肠道双歧杆菌菌群的差异影响

计算双歧杆菌菌群的alpha多样性，以评价LCZ干预的效果。有趣的是，只有将数据亚群划分为北部（包括内蒙古、蒙古、新疆和甘肃）和南部（包括印度尼西亚和新加坡）地区时，一些双歧杆菌种类的菌群多样性和组成才存在显著差异。但当它们被认为是六个独立的亚洲地区时就不同（补充图S3；在新疆和印度尼西亚，停止食用益生菌后，观察到更剧烈的变化（补充图S4A和S4B）；蒙古、新疆、甘肃和印度尼西亚也发现了一些差异显著的物种（补充图S4C）。在给药LCZ 1或2周后，北部受试者动物双歧杆菌和Bifidobacterium moukalabense的相对丰度显著增加，而南部受试者则没有（图4A）。在LCZ干预14天后，动物双歧杆菌的相对丰度显著增加，但在停止益生菌摄入14天后，这种趋势逆转（图4A）。摄入LCZ对南北区肠道双歧杆菌β多样性（PCoA）的影响存在显著差异（Adonis检验，P=0.005；图4B）。此外，在LCZ干预后不久，南部地区肠道双歧杆菌菌群加权UniFrac距离显著增加（P<0.05），而北部地区则无显著增加（P>0.05；图4 C）。之后，亚洲北部受试者的加权UniFrac距离减小，而亚州南部受试者的加权UniFrac距离增加，且受试者在停止摄入LCZ 14天后，加权UniFrac距离显著增加（图4C）。这些结果表明，LCZ干预引起了南北部受试者肠道双歧杆菌的不同反应。

 图4 干酪乳酪杆菌张对亚洲不同地区肠道双歧杆菌菌群的影响。A LCZ干预对南北地区差异双歧杆菌种的影响。B亚洲北部和南部地区肠道双歧杆菌菌群β多样性在LCZ干预后的变化。C在亚洲北部和南部受试者中，LCZ摄入量对肠道双歧杆菌菌群加权UniFrac距离的影响。误差条表示标准偏差。分别提供了显著不同对的P值。（原文图3）

5 LCZ对6个不同区域肠道双歧杆菌菌群的差异影响

在LCZ干预过程中，不同区域受试者的双歧杆菌菌群的加权UniFrac距离存在一些差异。例如，印度尼西亚和内蒙古受试者的加权UniFrac距离在LCZ摄入后的第7天和第14天均显著增加，而在LCZ停用后（第28天）则出现下降趋势。在LCZ干预后，甘肃受试者肠道双歧杆菌菌群的加权UniFrac距离增加，在LCZ停用2周后显著下降。相比，在第28天新加坡受试者的加权UniFrac距离显著下降，尽管在干预过程中，LCZ并没有引起加权UniFrac距离的显著变化。摄入LCZ 14天后，新疆受试者肠道双歧杆菌菌群加权UniFrac距离显著降低。蒙古受试者肠道双歧杆菌菌群的加权UniFrac距离未观察到显著影响（图5A）。LCZ似乎对不同区域的肠道双歧杆菌菌群产生不同的反应。

6 青春双歧杆菌有利于肠道双歧杆菌菌群的稳态

为了进一步研究摄入LCZ后基线双歧杆菌组成与肠道双歧杆菌菌群加权UniFrac距离之间是否存在关联，进行了Spearman的相关性分析（图5B）。研究发现，肠道双歧杆菌的加权UniFrac距离与受试者在第0天的基线双歧杆菌组成显著相关（图5B）。5种双歧杆菌分别为青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌和长双歧杆菌，与肠道双歧杆菌菌群的稳定性显著相关（通过加权UniFrac距离反映）。新加坡和印度尼西亚两组受试者肠道双歧杆菌菌群的相对丰度与加权UniFrac距离呈显著负相关，而短双歧杆菌的相对丰度与加权UniFrac距离呈显著正相关。此外，新加坡受试者肠道长双歧杆菌水平与加权UniFrac距离在第14天和第28天呈显著正相关。LCZ干预后，新疆受试者青春双歧杆菌在基线时与加权Unifrac距离呈显著负相关，而两歧双歧杆菌水平与加权Unifrac距离呈显著正相关。LCZ干预后甘肃受试者肠道青春双歧杆菌与加权Unifrac距离呈显著负相关，而链环双歧杆菌与加权Unifrac距离呈显著正相关。蒙古受试者摄入LCZ后，肠道短双歧杆菌与加权Unifrac距离呈显著正相关，而内蒙古受试者在LCZ干预后，双歧杆菌种类与加权Unifrac距离无显著相关性（图5B）。值得注意的是，在新加坡、印度尼西亚、新疆和甘肃的受试者中，青春双歧杆菌的相对丰度与肠道双歧杆菌菌群的加权UniFrac距离呈显著负相关；与此同时，在LCZ干预后，青春双歧杆菌的相对丰度增加（图5C），表明青春双歧杆菌在维持肠道菌群稳定方面具有潜在的有利作用。

 图5 摄入干酪乳酪杆菌张对肠道双歧杆菌稳态的影响。A LCZ摄入量对亚洲6个地区加权UniFrac距离的影响。B不同地区受试者摄入LCZ后肠道特异性双歧杆菌基本水平与加权UniFrac距离的Spearman相关性。使用R软件“psych”软件包计算Spearman相关系数和显著差异（*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001）。-1到0表示负相关，0到1表示正相关。C LCZ干预过程中青春双歧杆菌相对丰度的变化。误差条表示标准偏差。分别提供了显著不同对的P值。（原文图4）

讨论

我们之前的工作观察了LCZ干预后基于区域的不同反应。鉴于肠道双歧杆菌对健康的显著影响，本研究应用先前设计的双歧杆菌特异性引物（Bif-6）结合宏基因组测序来追踪在LCZ干预期间和之后来自6个亚洲地区的同一组受试者中这组特定微生物。 首先，对粪便中双歧杆菌的微生物组成和结构进行了表征。在亚洲成年人肠道中鉴定出5种优势双歧杆菌，为青春双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、两歧双歧杆菌和角双歧杆菌。所有这些物种都是典型的成年人类肠道相关物种。通常，肠道双歧杆菌被认为是促进健康的微生物，近年来的研究进一步支持了这一观点，并发现其在医学相关情况下的新功能，如抑制肠道病原体生长的积极作用，增加了治疗炎症性肠病的效果，并改善了宿主的甲状腺功能。本研究中发现的一些主要肠道双歧杆菌也在宿主体内发挥重要作用。例如，青春双歧杆菌可以通过影响宿主氧化应激相关的新陈代谢来调节衰老；短双歧杆菌产生醋酸盐，促进B10细胞参与抗炎症以及通过Tip60组蛋白乙酰转移酶复合物激活肠道固有免疫。因此，双歧杆菌在宿主的新陈代谢和健康中起着至关重要的作用。 这与6个亚洲地区的受试者肠道菌群的地理差异的观察结果一致，南北地区受试者的肠道双歧杆菌种群结构存在明显差异。已知多种宿主和环境因素会影响肠道菌群的结构和组成。通过对中国各地区的肠道菌群进行大规模测序分析，在多因素分析后得出，受试者的地理位置是影响其肠道菌群的最重要因素，因为居住的地理位置也代表了生活方式和饮食的混合影响。我们研究的北部和南部地区在地理上相距很远。北部地区，包括蒙古和中国的3个省份（内蒙古、新疆、甘肃），位于北温带，而南部地区（印度尼西亚和新加坡）位于热带地区。Hou等人调查了所有志愿者的饮食习惯，发现不同地区志愿者的饮食存在明显差异，尤其是对主食、肉类和乳制品的偏好。南北地区在地理特征、温度、湿度和宗教信仰等方面也存在明显差异，这可能导致它们的肠道菌群和双歧杆菌组成存在显著差异。 然后，我们利用南部和北部地区受试者基线肠道菌群的明显差异，来调查个体的基线肠道菌群是否对宿主对益生菌干预或其他饮食干预的反应有任何影响。个体基线肠道菌群的生态组成是否会在特定的临床相关场景中影响益生菌的使用结果，这一问题仍存在一定的争议。鉴于肠道菌群与多种疾病密切相关，且肠道菌群失调易导致个体出现多种健康问题，本研究分析比较了南北地区受试者粪便中益生菌驱动的双歧杆菌菌群变化。有趣的是，数据显示LCZ干预导致了两组受试者之间不同的肠道菌群反应。LCZ干预对南亚地区受试者的肠道双歧杆菌菌群beta多样性（加权UniFrac距离）有显著影响，但对北部地区受试者的影响较小，这表明2个地区受试者肠道双歧菌群的稳定性存在内在差异。这一发现与Hou等人之前的观察结果一致，即益生菌驱动的整体肠道菌群反应也与个体的基础肠道菌群相关。研究还发现，南北地区的受试者对肠道动物双歧杆菌的反应存在差异。特别是，14天的LCZ干预显著增加了北亚受试者肠道动物双歧杆菌的相对丰度，而在停用LCZ 2周后，该丰度下降，这意味着需要持续摄入益生菌才能维持观察到的长期效果。相比之下，肠道双歧杆菌中这种剧烈的变化在南部群体中没有发生。此外，肠道微生物驱动的反应只在某些类群中观察到，而在其他类群中没有观察到。Noh等人发现，摄入益生菌不会显著改变受试者的整体肠道菌群结构，但某些类群的丰度确实有所增加，包括乳酸杆菌和肠球菌。McNulty和同事在一项为期7周的发酵乳干预研究中也做了一个有趣的观察，该研究由5种乳酸菌组成，其中动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-2494是发酵乳干预后微生物群中最显著的检测成员。因此，益生菌驱动的肠道菌群变化可能只发生在受试者肠道菌群的特定类群中。 此外，数据发现肠道青春双歧杆菌的水平与受试者肠道菌群的变化之间存在显著的相关性（通过加权UniFrac距离反映）。研究结果还表明，北部地区青春双歧杆菌的基础水平高于南部地区。LCZ干预后，青春双歧杆菌的相对丰度有数值上的增加，北部组尤其明显。这些结果推测，青春双歧杆菌有利于维持肠道双歧杆菌菌群的稳定性。之前的一项研究发现，拥有大量肠道青春双歧杆菌的受试者，其肠道菌群受到益生菌发酵牛奶等外力干扰的可能性较小。青春双歧杆菌可以利用淀粉或低聚果糖作为生长基质，而不能利用淀粉或低聚果糖的丁酸菌可以以青春双歧杆菌形成的乳酸和醋酸盐为食。此外，普拉梭菌产生丁酸盐，进而提高肠道青春双歧杆菌的水平，并维持健康个体的结肠内稳态。双歧杆菌，尤其是青春双歧杆菌，很可能通过交叉喂养等机制相互合作，并与其他肠道微生物合作，以恢复肠道微生物生态系统并促进肠道菌群的内部平衡，而不是改变其组成。特定的环境干扰是否会改变肠道菌群的稳定性取决于菌群对扰动类型的适应能力，而这种适应能力至少部分依赖于宿主的基础肠道菌群。我们的研究结果支持了初始肠道菌群结构和组成是应用益生菌或其他饮食干预时需要考虑的重要宿主因素，因此需要根据个体初始菌群组成的特点来设计个性化的益生菌干预方案。 综上所述，本研究对来自6个亚洲地区的受试者的肠道双歧杆菌菌群进行了分析。不同地区肠道双歧杆菌菌群的主要种类为青春双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、两歧双歧杆菌和角双歧杆菌。摄入LCZ对亚洲南部和北部地区的肠道双歧杆菌菌群有不同的调节作用。此外，青春双歧杆菌与益生菌驱动的肠道双歧杆菌菌群多样性变化相关，表明其在维持肠道双歧杆菌种群的整体稳定性中可能发挥作用。对不同地区受试者肠道菌群组成的内在差异及其肠道双歧杆菌群中各自的不同反应的观察，为某些益生菌菌株在特定地理区域或种族中的使用是否更有效提供了有趣的见解。需要进行独立的长期临床试验来进一步验证其功能。

结论

本研究对来自6个亚洲地区的受试者的肠道双歧杆菌菌群进行了分析。发现摄入LCZ对亚洲南部和北部地区的肠道双歧杆菌菌群有不同的调节作用，且益生菌诱导的肠道双歧杆菌菌群反应随受试者的地理来源而变化，而青春双歧杆菌可能在维持肠道双歧杆菌种群的整体稳定性中发挥作用。本研究为某些益生菌菌株在特定地理区域或种族中的使用是否更有效提供了有趣的见解。