抑制Rac1表达对高糖诱发神经元损伤后线粒体自噬的影响

赵敏溪陶媛媛 周婉晴 胡婕 刘卓懿 夏萍萍 王锷 郭曲练 叶治

中南大学湘雅医院麻醉科，长沙 410008

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(06):561-565.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20211028-00558

 基金项目 

国家自然科学基金（81771422）；

湖南省自然科学基金（2019JJ50931）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟评价抑制 Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）表达对高糖诱发神经元损伤的影响，为明确机制提供依据。

1 材料与方法     

对数生长期PC12细胞接种于6孔板，采用随机数字表法将细胞分为4组（每组3孔）：正常浓度葡萄糖组（C组）、高浓度葡萄糖组（HG组）、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组（HG+shRac1组）、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组（HG+NC组）。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h，HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h，HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h，HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。

Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl‑2/腺病毒E1B相互作用蛋白３（BNIP3）和p62蛋白水平，并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ；CCK‑8法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡率；二氢溴化乙啶法检测细胞活性氧（ROS）水平；荧光定量PCR法检测自噬相关基因7（Atg7）、三磷酸腺苷酶6（ATPase6）和60S核糖体蛋白L13（Rpl13）相对表达量，并计算ATPase6/Rpl13。

2 结 果      

2.1　4组PC12细胞ROS水平、细胞活力、凋亡率比较

与C组比较，HG组ROS水平（t=−20.9，P<0.001）和细胞凋亡率（t=−12.8，P<0.001）升高，细胞活力（t=29.5，P<0.001）下降；HG+NC组ROS水平（t=−30.5，P<0.001）和细胞凋亡率（t=−22.8，P<0.001）升高，细胞活力（t=14.6，P<0.001）下降；与HG+NC组比较，HG+shRac1组ROS水平（t=5.83，P=0.004）和细胞凋亡率（t=6.25，P=0.003）降低，细胞活力（t=−6.11，P=0.004）升高。见表1。

2.2　4组PC12细胞ATPase6/Rpl13、Atg7相对表达量比较

与HG+NC组比较，HG+shRac1组ATPase6/Rpl13降低（P<0.05），Atg7相对表达量升高（P<0.05）。见图1。

2.3　4组PC12细胞BNIP3、p62蛋白水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比较

与HG+NC组比较，HG+shRac1组BNIP3蛋白水平升高（P<0.05），p62蛋白水平降低（P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高（P<0.05）。见图2。

3 讨 论      

高糖细胞损伤是模拟高血糖神经元损伤的细胞模型。预实验结果提示随葡萄糖浓度升高，PC12细胞活力逐渐下降，PC12细胞在使用浓度为45 g/L的葡萄糖处理24 h后，细胞活力被抑制近40%。此外，为了排除高渗透压的作用，预实验中我们在正常浓度葡萄糖组（含葡萄糖4.5 g/L）的DMEM培养基添加适量甘露醇，使其最终产生的渗透压与45 g/L葡萄糖相当，处理PC12细胞24 h后发现其细胞活力与正常浓度葡萄糖组比较差异无统计学意义。故细胞实验中HG组采用葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养24 h。

本研究结果表明，HG组较C组细胞活力下降，ROS水平和细胞凋亡率升高，提示高糖可诱发神经元损伤。HG+shRac1组较HG+NC组ROS水平和细胞凋亡率降低，细胞活力升高，Atg7和BNIP3蛋白水平升高，p62蛋白水平降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，ATPase6/Rpl13降低，提示抑制Rac1可减轻高糖引起的神经元损伤，其机制可能与增强线粒体自噬有关。

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