合成生物学竞赛-创新赛之北京理工大学团队: “灵捕”——基于LAMP-CRISPR耦合滑动芯片和智能手机的miRNA检测系统

iSynBio造物联合合成生物学竞赛推出《大赛项目揭秘专题》，本期为第八期，嘉宾为北京理工大学BIT团队，参赛项目为“灵捕”——基于LAMP-CRISPR耦合滑动芯片和智能手机的miRNA检测系统。

联合发布：《合成生物学》期刊、生物世界、iSynBio爱星博、深圳市合成生物学协会。

项目内容概述

本项目构建了“灵捕”系统：一种基于LAMP-CRISPR耦合滑动芯片及智能手机的miRNA检测系统，能实现现场快速即时诊断(point-of-care testing, POCT)，主要面向癌症早筛应用。该系统在生物传感器的基础上，通过滑动芯片对检测的各个环节进行集成，同时利用微信小程序实现了智能手机实现交互与可视化。

Fig. 1 项目简要示意图          

项目背景

结直肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。随着社会经济水平的提高及生活和饮食结构的改变，我国结直肠癌总体发病率与死亡率呈现明显上升趋势。结直肠癌患者Ⅳ期5年生存率为8%，而Ⅰ期5年生存率可以达到87.9%，在患者早期完成结直肠癌的诊断具有十分重要的意义。 目前临床采用的筛查方法有胃肠镜检查、低剂量CT筛查及粪便隐血试验等，但仍存临床检测成本较高，以及各类并发症或机体损伤的问题，目前临床普及性较高的癌症早期筛查手段均具有一定的局限性，临床迫切需要一种高效、安全的筛查方法。  

Fig. 2 目前的癌症筛查方法（以结直肠癌为例） 

微小核糖核酸（miRNA）是在进化上保守的，由19~22个成熟核苷酸组成的小分子非编码调节单链RNA序列。miRNA的功能涉及到各种生理病理过程，在癌症及相关癌前病变的不同疾病阶段以及不同的发病部位之间都存在较为显著的表达差异，并且已有多种miRNA被证实是有效的癌症早筛标志物，实现其检测意义重大。

Fig. 3 miRNA可作为多种癌症的生物标志物[1]

然而miRNA体积小、体内体外含量较低等特点对检测方法的开发提出了更高的要求。Northern印迹杂交、微阵列以及原位杂交等常规检测方法大多具有成本较高、选择性较差、操作时间长等问题，应用场景受到限制。另一类可用于检测miRNA的常用方法RT-qPCR核酸扩增技术，可以通过复杂的探针设计将较短的miRNA序列变成较长的靶标，但作为变温扩增方法，需要大型且较为昂贵的热循环仪，其在资源有限的环境中的应用受限。在此基础上，研究人员提出等温扩增以提高序列特异性、简化扩增系统，等温扩增可以在恒温下实现快速有效的扩增，大幅降低检测设备的开发成本，可用于短链miRNA的检测。

Fig. 4 不同基因检测中的微流控LAMP系统[2] 

目前，miRNA检测存在用时较长、检测成本较高、需要设备较多等问题。即时检验（POCT，point-of-care testing）的miRNA检测系统，则是一类能够在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的新方法。本项目希望由滑动微流控芯片以及智能手机共同构建更具环境部署性与信息关联性的POCT系统，来实现方便、快捷的miRNA检测。      

项目优势

Fig. 5 微信小程序示例图

项目总体技术路线‍

Fig. 6 “灵捕”系统设计总方案      

项目关键设计

1.生物传感器的设计

“灵捕”系统充分整合LAMP等温扩增技术、CRISPR/Cas检测技术、荧光共振能量转移（FRET）等诊断学的新技术、新方法，通过LAMP实现miRNA的等温扩增，采用CRISPR/Cas12a系统特异性识别扩增产物并输出荧光信号，建立荧光强度与miRNA浓度的关系以实现定量检测[3]。

Fig. 7 生物传感方法

2.基于生物检测的硬件设计 项目设计了滑动芯片用以整合复杂的实验室操作，既可以保持LAMP简便、快捷、高效等优点，又能以较少的试剂消耗实现检测，在此基础上构建相应的小型化设备以提供反应温度、检测荧光结果。

Fig. 8 硬件和软件设计

3.软件设计

“灵捕”系统还搭建了基于智能手机的小程序平台，以实现对设备的控制及结果的可视化。

4.建模流程设计

建模部分以结直肠癌为癌症代表，通过生物信息学方法，筛选结直肠癌相关miRNAs用于检测方法开发中检测对象的确定；并建立综合风险评分模型，基于检测到的用户样本中多种miRNA的含量，综合评价其患癌风险。

Fig. 9 建模流程设计      

项目主要成果

1.LAMP-CRISPR反应的表征

项目首先验证LAMP-CRISPR检测miRNA的可行性，采用体系终浓度为5pM的miRNA-21进行LAMP引物连接反应、LAMP扩增及CRISPR/Cas12a三步实验，以证实这一检测原理的可行性（Fig. 10(A), 10(B) ）。无LAMP扩增反应证明了LAMP扩增反应的必要性：将miRNA转换为CRISPR/Cas12体系可识别的双链结构，并对miRNA信号进行放大（Fig. 10(C)）。

Fig. 10 LAMP-CRISPR反应的表征

A凝胶电泳图中，NC是阴性对照组；A1、A2是标准阳性组crRNA；B1和B2实验组crRNA。

2.LAMP-CRISPR/Cas体系用于miRNA的定量检测

测试生物传感系统对miRNA的检出限，设置miRNA浓度梯度为500fM，50fM，5fM,0.5fM,0.05fM，构建检测标准曲线（Fig. 11(C)），结果表明miRNA的浓度与荧光强度具有线性关系，相关系数达93.13%，得出检测的标准曲线LOD为0.069fM。

Fig. 11 miRNA检出限测定

3.硬件基础及配套试剂优化

为在滑动芯片上实现miRNA检测试剂的预包埋，本项目设计采用冻干珠替代LAMP试剂、CRISPR试剂，并实验验证可行。在滑动芯片中进行单独LAMP反应和LAMP+CRISPR反应，通过荧光显微镜观测结果，发现滑动芯片和温度控制模块可以有效实现LAMP与CRISPR步骤，荧光检测模块经测试可以正常使用。

Fig. 12 荧光显微镜下LAMP和LAMP+CRISPR反应结果观察图  

Fig. 13 温度控制模块和荧光检测模块

4.软件开发

使用者在使用时仅需按照微信小程序的操作提示进行加样操作即可完成仪器的使用，可以将反应主体部分拉出以进行反应试剂加样。

Fig. 14 微信小程序示例图   

【参考文献】     [1] Cortez MA, Bueso-Ramos C, Ferdin J, Lopez-Berestein G, Sood AK, Calin GA. MicroRNAs in body fluids--the mix of hormones and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 2011 Jun 7;8(8):467-77.     [2] Trinh, K. T. L., et al. (2019). "Fully integrated and slidable paper-embedded plastic microdevice for point-of-care testing of multiple foodborne pathogens." Biosensors and Bioelectronics 135: 120-128.     [3] Zhang, M., et al. (2021). "CRISPR/Cas12a-Assisted Ligation-Initiated Loop-Mediated Isothermal Amplification (CAL-LAMP) for Highly Specific Detection of microRNAs." Analytical Chemistry 93(22): 7942-7948.