【检验案例】抗凝管标本中竟出现胶冻状凝块，究竟是何原因？

作者：沈逸枫 朱晶

单位：复旦大学附属中山医院检验科

冷球蛋白（Cryoglobulins）是一类在低温环境中发生沉淀，在37℃又溶解的免疫球蛋白。临床实验室须严格按照特殊预温要求执行分析前和分析中的处理步骤，才能在冷球蛋白的检测和鉴定过程中避免假阴性结果。

冷球蛋白在常规操作过程中会对生化检测结果造成怎样的影响？我们又该如何发现并正确处理呢？

冷球蛋白是什么？[1,2]

冷球蛋白是血液中能发生可逆冷沉淀的蛋白，一般在4℃发生沉淀，在37℃又溶解。1947年，Lerner等人证实其本质为γ球蛋白，并命名为冷球蛋白。基于单克隆性质和免疫球蛋白种类，冷球蛋白分为三型：

Ⅰ型冷球蛋白：单克隆型，常见为IgM、IgG，IgA和单克隆轻链型则较为罕见。此型冷球蛋白在血中浓度较高（可达到5-20 g/L），多见于淋巴细胞增生性疾病，如意义未明的单克隆丙种球蛋白病、华氏巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。常伴高黏滞综合征，并易沉积堵塞小血管致病。患者可出现皮肤青斑、肢端发绀以及雷诺现象。

II型和III型冷球蛋白：II型为单克隆混合多克隆免疫球蛋白，III型为多克隆免疫球蛋白，两者约占冷球蛋白90%。常见单克隆和多克隆IgM，而相对罕见的IgG和IgA往往具有类风湿因子活性。这也导致了在低温环境下，免疫复合物沉积于血管内皮细胞表面。混合的冷球蛋白通常继发于感染，尤其是慢性丙型肝炎病毒（HCV）、细菌或寄生虫感染。约一半的混合型冷球蛋白继发于HCV感染，此外也与血管炎或B细胞淋巴瘤相关。混合型冷球蛋白也继发于自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮和干燥综合征，III型冷球蛋白更为多见。

冷球蛋白血症会对哪些检测项目产生影响？

由于冷球蛋白在血液凝固及低温离心过程中会发生沉淀析出，易造成血清中部分蛋白检测结果假性偏低，如总蛋白、球蛋白、血清蛋白电泳γ区百分比、M蛋白百分比、补体4和类风湿因子等。如果冷球蛋白血症未被发现和纠正，会导致部分项目检测结果错误，甚至影响临床诊疗决策[1,2,3]。

如何发现冷球蛋白？

以下是本科室发现的一例典型的I型冷球蛋白血症：

患者男性，52岁，因颅内压增高，反复头痛头晕8月，加重伴视物模糊，收治于神经内科监护室。右侧臀部及左侧腋窝至腕部不规则瘀斑。入院生化常规检测结果出现以下异常情况（表1）

表1 患者部分生化项目检测异常结果

查看反应曲线，ALT的吸光度异常升高且反应曲线不成线性（图1）。

备注：“▲”为正常反应曲线；“●”为该患者异常反应曲线

图1 异常反应曲线

面对这种情况，我们首先观察标本性状是否异常。该血清虽澄清透亮却非常粘稠，流动不畅如油状，重新离心后下层血凝块与分离胶仍未分离（图2）。

图2 该患者血清样本

EDTA-K2抗凝管血浆中存在胶冻状凝块，且凝块与血浆和血细胞层之间有明显分界（图3）。

图3 该患者EDTA-K2抗凝管标本

追问患者情况，得知其外院住院期间曾在抽血1-2 分钟内发生抗凝管标本凝血，标本离心后血浆呈浆糊状。此外，患者增高的IgM结果引起了我们的注意，进一步查看该患者的毛细管血清蛋白电泳图谱显示在γ区存在尖峰，提示可疑M蛋白。根据峰面积可疑M蛋白占比约4.8%（图4左）。免疫固定电泳结果显示大部分泳道均出现浓集条带（图4右），说明存在免疫聚合物干扰。

图4 标本的血清蛋白电泳图以及免疫固定电泳图

我们采用对免疫聚合物抗干扰能力较强的毛细管电泳免疫分型进行M蛋白定型[4]，结果显示M蛋白为IgM-κ型（图5）。

图5 患者标本的毛细管电泳免疫分型图

单克隆免疫球蛋白IgM为五聚体结构，分子量大易干扰生化仪器检测的吸光度，而标本性状粘稠也易发生吸样误差导致检测结果错误。在琼脂糖凝胶电泳中，IgM高度聚合的片段陷入凝胶无法正常随电场迁移，在泳道出现沉淀条带。

该患者血清中存在IgM型单克隆免疫球蛋白，血清性状粘稠且抗凝管标本中出现胶冻状凝块，同时患者有颅内压增高和体表有不规则瘀斑。根据这些线索我们怀疑这是一名冷球蛋白血症患者，因此需要对该患者按特殊预温流程进行重新采样检测。

冷球蛋白应该如何检测？

本实验室参考使用英国国家外部质量评估机构（UKNEQAS）推荐的冷球蛋白纯化以及检测流程（图6）  

图6 UKNEQAS推荐的冷球蛋白纯化及检测流程[1]

我们立即请病房护士改用37℃预温的采血针与采血管，并于37℃恒温运送标本。标本送到后立即放置37℃温浴箱1小时，待血块完全凝固收缩后，于37℃和3000 r/min离心10分钟以分离血清。

将温浴血清置于4℃环境，1分钟内立即出现沉淀，并逐渐凝固成胶冻状（图7）。再将其重新置于37℃中孵育2 h，血清中胶冻状沉淀溶解，即血清冷球蛋白定性试验结果为阳性。

图7 血清置于4℃环境中出现沉淀

为了进一步对冷球蛋白鉴定，我们使用预温采集的血清重新进行血清蛋白电泳（图8左），结果显示γ区尖峰较之前（图4左）明显升高。将4℃凝固成胶冻状的血清离心后，弃上清取下层冷球蛋白，用生理盐水反复洗涤离心后，取少量沉淀溶于5% β-巯基乙醇（排除免疫聚合物干扰）后进行免疫固定电泳：虽然泳道同一位置仍有免疫聚合物沉淀线，但IgM和κ泳道出现浓集条带（图8右），说明这部分沉淀为单克隆IgM-κ型免疫球蛋白，即I型冷球蛋白。至此，我们终于找到了导致该患者检测结果异常的“罪魁祸首”。

在确证患者血清中含有冷球蛋白后，我们重新检测了预温采集的血清标本，不仅ALT、AST、PA和APO-E的检测均恢复正常，还纠正了假性偏低的总蛋白（TP）、IgG、IgA、IgM以及 M蛋白含量（表 2）。

图8 预温处理后的血清蛋白电泳和免疫固定电泳图谱

表2：该患者部分生化项目检测结果纠正前后对比

总结

由于冷球蛋白血症患者的血清标本外观往往并无明显异常，难以发现，但是这部分因沉淀析出而“消失”的蛋白一旦被忽略会对患者的临床诊疗造成影响。因此我们需要提高对冷球蛋白血症的认识，若发现高粘滞的血清标本须提高警惕，时刻关注检测过程中的异常情况，及时发现蛛丝马迹，抓住这个影响血清标本检测的“罪魁祸首”——冷球蛋白。

知识拓展

冷球蛋白血症与冷凝集素综合征如何鉴别？  

说到冷球蛋白血症，那就不得不提到另一位“冷血”家族成员——冷凝集素综合征。因为两者都会造成皮肤发绀、雷诺现象、网状青斑以及坏疽，所以从临床症状的角度看似像“孪生兄弟”。但其实这两种疾病从发病机制再到疾病诊断和治疗均不相同，两者的区别详见表3。  

表 3 冷球蛋白血症和冷凝集素综合征的区别

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编辑：青翠欲滴

校审：晨晨

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