【中西合璧】特定频率的电针可促进NGF通过血脑屏障改善MCAO/R大鼠的学习和记忆功能

上海中医药大学附属岳阳医院麻醉科

背景：

缺血性脑卒中可导致成年人残疾和死亡。85%的脑卒中幸存者合并长期失能的后遗症，如运动、感觉障碍，以及学习、记忆能力受损。缺血性脑卒中主要累及大脑中动脉（MCA），该动脉为大脑的感觉、运动中枢区域提供氧气和营养。血脑屏障(BBB)动态而稳定地控制大脑和血液之间的物质交换，是维持大脑内环境平衡的关键，其通透性的瞬时增加在帮助大分子药物进入大脑治疗缺血性脑卒中时发挥重要作用。而在缺血性脑卒中发生后，BBB的修复需要2-3周的时间，因此寻找一种安全、有效、无创、可重复改善BBB通透性的方法对缺血性脑卒中的治疗具有重要意义。

研究表明，电针(EA)可增加脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的通透性，而不引起明显的脑水肿。在最近的一项综述表明，以百汇穴(GV20)为基础的头皮针刺在局灶性脑缺血动物模型中的疗效确切；另一项研究表明，GV20和水沟穴(GV26)反复电针治疗可显著提高缺血性脑梗死大鼠的感觉运动能力。因此，EA可能是临床中治疗脑卒中等中枢神经系统疾病的一种可靠、有效的方法，但其疗效是否与BBB通透性改善相关尚不明确。

神经生长因子(NGF)是第一个被发现的营养神经物质，在调节神经元的发育、分化、可塑性、细胞存活方面发挥着积极的作用。然而，NGF的相对分子质量约为13.4 kDa，在正常情况下很难通过血脑屏障，难以达到其有效浓度以发挥其治疗作用。研究表明EA刺激GV20和GV26可提高BBB的通透性，从而促进与NGF分子相似的20 kDa FITC-葡聚糖通过BBB。

基于以上背景，本研究作者使用右侧大脑中动脉阻塞（MCAO/R）模型，研究特定频率的EA是否可以改善BBB通透性，诱导NGF进入大脑，发挥其治疗作用。实验分三部分进行。首先，确认MCAO后BBB修复的持续时间。其次，使用特定参数EA初步探索其诱导NGF通过BBB的能力，并明确NGF是否被神经元吸收。最后，评估NGF对电针刺激下MCAO/R大鼠学习和记忆的治疗作用，为使用电针诱导中枢神经系统靶向药物透过BBB治疗缺血性脑卒中提供理论依据。该研究成果发表在Journal of Integrative Neuroscience杂志上，中西合璧专栏对该文献进行了编译，以飨读者。

方法：

动物：本研究中的所有程序均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。使用3个月大的成年雄性大鼠（SD），体重250-270 g。所有大鼠均保持12小时的光/暗循环，并可随意获得食物和水。

MCAO模型的建立：允许大鼠自由饮水，然后用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔内麻醉。在无菌条件下仔细暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），并将其与迷走神经分离。通过CCA残端将线插入ICA并向前推进，从而阻断MCA。在整个手术过程中监测并维持体温在36.5–37.5℃。缺血90分钟后，抽出缝线以诱导再灌注。麻醉恢复后，将大鼠放回笼中，并提供食物和自由饮水。

神经功能缺损试验：本次评估采用了改进的评分系统：0、无明显神经功能缺损（正常）；1、提尾时无法伸展左前爪（轻度缺陷）；2、行走时轻度向对侧盘旋（中度缺陷）；3、滑向对侧（瘫痪侧）（严重缺陷）；4、在没有失去意识的情况下无自主行走的能力（非常严重的缺陷）。MCAO成功诱导的标志是大鼠的神经功能缺损评分为1到3分。在本研究中，排除了38只死于肺功能不全或蛛网膜下腔出血和窒息的大鼠。

试验1：雄性SD大鼠随机分为以下五组：（1）对照组；（2）MCAO-24小时组；（3）MCAO-72小时组；（4）MCAO-2周组；（5）MCAO-3周组。MCAO组大鼠接受了MCAO诱导手术，而对照组没有。每组进一步随机分为三个亚组（A、B和C），评估脑梗死面积、血脑屏障的超微结构变化和血脑屏障的通透性。

试验2: 在试验1的基础上将血脑屏障基本修复的组作为MCAO/R模型组（MCAO术后3周）。将这些MCAO/R大鼠随机分为MCAO模型组和MCAO模型-EA组。同时建立对照组和EA组。EA组针刺GV20（百会，顶骨中心）和GV26（水沟，鼻尖下1 mm）。然后将针尾连接到穴位刺激器，并以2/100 Hz的频率和2 mA的强度进行40分钟的刺激。根据尾静脉注射的药物（NGF溶液或FITC-NGF溶液），将各组进一步随机分为两个亚组。A亚组大鼠注射NGF（10µg/kg），B亚组大鼠注射FITC-NGF（10µg/kg）。注射NGF或FITC-NGF后，对照组和MCAO/R模型组大鼠休息40分钟，而电针组大鼠立即给予电针治疗。使用分光光度计评估NGF渗透程度，使用激光共焦显微镜和数字病理切片（荧光）扫描分析仪评估FITC-NGF渗透程度。

试验3: 根据试验2的结果，确定了电针的传递频率。将MCAO/R大鼠（术后3周）随机分为MCAO模型组、MCAO模型-NGF组、MCAO模型-EA组和MCAO模型-EA -NGF组，以及对照组。MCAO模型-NGF组和MCAO模型-EA- NGF组大鼠注射NGF溶液（10µg/kg），每天1次，共6天，MCAO模型组和MCAO模型-EA组大鼠尾静脉注射等量的盐水。每次注射后，电针组用针刺针和穴位刺激器（2/100 Hz，2 mA，40分钟，6秒开/6秒关）进行治疗。在每次注射之前，对大鼠进行Morris水迷宫测试，以评估其学习和记忆能力。在第6天将大鼠斩首。取脑，TUNEL染色测定神经元凋亡。

统计分析：

数据表示为平均数的±标准差。使用SPSS 20.0进行统计分析。对于正态分布的测量值，两组之间的比较采用非配对的t检验，≥3组之间的比较采用单因素方差分析，然后采用Tukey’s的事后检验。对于非正态分布的测量值，分别使用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验来进行两组之间和三组或三组以上组间比较。如果P<0.05，则认为比较有显著性差异。

结果：

1.脑缺血后脑梗死体积随时间变化

大鼠大脑中动脉闭塞后，外侧皮质出现广泛病变。图1A、B显示，在MCAO组中，大脑中动脉供血的大脑区域及其附近发生不同程度的脑梗死。正常组织呈深红色，而梗死区呈白色。图1B显示，MCAO组的脑梗死体积高于对照组。与MCAO-24小时组、MCAO-72小时组和MCAO-2周组相比，MCAO-3周组的脑梗死体积显著降低。对脑缺血体积差异的分析表明，在MCAO后，MCAO-24小时组和MCAO-72小时组大鼠的大脑抑制程度最高，而MCAO-2周组和MCAO-3周组缺血半暗带中的脑组织处于修复过程中。

图1:MCAO术后BBB修复时间

2.大脑中动脉闭塞三周后，血脑屏障基本修复

如图1C所示，电镜显示对照组大鼠的血管腔大小和形状正常，血管内皮细胞光滑、不肿胀、排列紧密。为了确定BBB的可测量性，我们使用埃文斯蓝 (EB)作为示踪剂。如图2A所示，在对照组中，通过大脑皮层半球的血管几乎看不到EB。如图2B所示，对照组的荧光强度低于MCAO-24小时组和MCAO-72小时组。与MCAO-3周组相比，MCAO-24小时组和MCAO-72小时组的平均荧光强度更高，差异有统计学意义。虽然MCAO-3周组的荧光强度高于对照组，但差异不显著。这些结果表明，脑缺血三周后，血脑屏障功能基本修复，阻止大分子自由进入和离开大脑。

图2:MCAO术后BBB修复时间

3.特定频率下的电针刺激增强了BBB通透性

通过测量在电针刺激后渗透到大鼠前额叶皮质的NGF和FITC-NGF水平，确定了电针诱导BBB通透性最大增强的具体频率。图3A显示，对照-EA组的NGF渗透高于对照组，但差异不显著；此外，与模型组相比，模型-EA组的NGF渗透增加。如图3B，C所示，FITC-NGF含量检测表明，对照-EA组的FITC-NGF表达显著高于对照组，模型-EA组的FITC-NGF渗透也高于模型组。前额叶皮层NGF和FITC-NGF含量的差异表明，特定频率的电针刺激增强了神经生长因子的表达BBB渗透性。

图3 特定频率的电针刺激可诱导NGF和FITC-NGF通过BBB。

4.电针刺激诱导前额叶神经元通过血管摄取FITC-NGF

在确定了EA对BBB渗透率影响最大的特定频率后，我们使用该频率的EA来评估FITC-NGF通过BBB的情况。如图4中脑组织切片的荧光图像所示，FITC-NGF在对照-EA组和模型-EA组中显示出灯笼状的血管浸润，但在对照组或模型组中没有。图5A、B所示，对照-EA组的FITC-NGF含量显著高于对照组。模型-EA组的FITC-NGF含量显著高于模型组，差异有统计学意义。因此，电针刺激促进NGF和FITC-NGF通过BBB，NGF可被神经元吸收。

图4 特定频率的电针可以打开BBB，促进FITC-NGF通过血管

图5 电针刺激诱导前额神经元通过血管摄取FITC-NGF

5.电针诱导神经生长因子进入大脑，促进大鼠学习记忆，抑制海马神经元凋亡

电针可以增强血脑屏障的通透性，通过使NGF通过血脑屏障来促进神经元对NGF的摄取。图6显示了大鼠学习和记忆能力的变化。与模型组和模型-NGF组相比，对照组在第5天行走的距离和寻找平台的延迟较短；但模型EA-NGF组并不显著大于对照组。在图6D第6天的探针试验中，模型-EA-NGF组越过目标象限的次数比模型组和模型EA组多。图7显示，模型-EA-NGF组的凋亡相关蛋白水平显著低于模型组、模型-NGF组和模型-EA组。我们还获得了右侧海马区的荧光图像，发现对照组的TUNEL染色非常低。这些结果表明，在电针刺激增加BBB通透性后，NGF进入大脑发挥其治疗作用，抑制海马细胞凋亡，促进大鼠学习记忆。

图6 电针诱导NGF进入大脑可以促进学习和记忆能力

图7 海马神经元凋亡

结论：

研究结果表明，MCAO后3周大鼠血脑屏障基本修复，这模拟了临床脑缺血的后遗症。对于生理条件下完整的血脑屏障和病理条件下修复的血脑屏障，增加通透性的方法对于促进有益物质进入中枢神经系统是至关重要的。本文研究表明，在特定频率的EA刺激下，NGF通过血脑屏障到达大鼠大脑，并被前额叶皮层神经元吸收，使其能够发挥药理作用。更重要的是，我们发现EA以特定频率刺激NGF进入大脑可以提高大鼠的学习记忆能力，抑制海马神经元的凋亡，为大分子药物治疗中枢神经系统疾病提供了一种新的方法。

中西合璧述评

大脑中动脉闭塞引起的病理过程与缺血性脑卒中相似，因此该阻塞大脑中动脉被广泛视为诱发局灶性脑缺血动物模型的标准方法。在本实验中，作者阻断了大鼠右侧MCA的血流制造缺血性脑卒中模型，即MCAO/R模型。模型可靠可信。

血脑屏障是一种复杂的结构，主要由内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞足突、基底膜和紧密连接（TJ）组成。生理条件下完整的血脑屏障和病理条件下重新配对的血脑屏障可阻止外周炎性物质的进入，并调节大脑和血液之间毒素和营养素的交换。但血脑屏障也是有益大分子进入大脑的一个障碍。许多实验研究旨在通过超声、鼻腔内给药和脑室内注射等方法破坏或绕过血脑屏障来给药，但这些方法很难应用于临床。因此，探索安全、有效、无创、反复促进血脑屏障通透性的实用方法，以促进药物向大脑的传递，既至关重要，也具有重要的临床意义。

有研究表明GV20下方某些神经和血管，如大枕叶神经和额叶神经分支分布丰富，由于其对中枢神经系统的影响，起着调节血液循环的作用。同时，三叉神经第二分支和面神经颊分支分布在GV26下，刺激该穴位可刺激三叉神经和面神经，作用于脑干，促进呼吸节律、高血压等脑功能。因此，本研究选择GV20和GV26作为EA刺激点，并观察其对血脑屏障通透性的影响。旨在将目前使用的参数下的EA应用于MCAO模型等病理模型，以促进NGF等大分子药物进入大脑，并为中枢神经系统疾病的治疗提供一种新的方法。

当前研究也同样存在局限性，首先，在电针刺激下，BBB打开和关闭的精确时间尚未确定。此外，文章对于不同频率的电针刺激参数并未进行比较，穴位电刺激引起BBB开放的最佳刺激频率将是今后研究的重点。

编译：高静雅   述评：许华      

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