对蛇尾草水提物草酸钙结晶动力学和晶体形态的体外影响：潜在的抗结石机制分析

对蛇尾草水提物草酸钙结晶动力学和晶体形态的体外影响：潜在的抗结石机制分析

De Bellis R, Piacentini MP, Meli MA, Mattioli M, Menotta M, Mari M, Valentini L, Palomba L, Desideri D, Chiarantini L. In vitro effects on calcium oxalate crystallization kinetics and crystal morphology of an aqueous extract from Ceterach officinarum: Analysis of a potential antilithiatic mechanism. PLoS One. 2019 Jun 25;14(6):e0218734. doi: 10.1371/journal.pone.0218734. PMID: 31238335; PMCID: PMC6592703.

Ceterach officinarum Willd 是一种遍布欧洲的植物，在意大利南部用作利尿剂。相信C的好处。铁皮水提物在治疗草酸钙肾结石方面被广泛持有。然而，关于其抗锂作用的实际机制知之甚少。我们在这项体外研究中的结果证实了C. officinarum水提物作为抗氧化剂的良好来源，具有很高的抗氧化作用。我们的结果也证明了C的主要影响。药草水提物在体外诱导草酸钙结晶动力学和晶体形态，显示其在肾结石形成和/或消除中的关键作用。我们表明，逐渐增加的C剂量。officinarum水提物引起一系列的影响。首先观察到对草酸钙一水合物 (COM) 生长和聚集的强大抑制作用。C. _ 厚朴水提取物在刺激成核方面似乎也非常有效，增加了 COM 晶体的数量并减小了其大小，COM 晶体以剂量依赖的方式逐渐变薄、变圆和凹陷。已知这些形状修饰的 COM 晶体与肾小管细胞的粘附性较低，并且更容易通过尿道排出，从而防止肾结石形成。此外，C . officinarum水提取物促进草酸钙二水合物 (COD) 的形成，而不是一水合物，因此，在使用的最高浓度下，仅观察到 COD 晶体，数量显着增加，其大小明显减小，呈剂量依赖性. 此外，AFM 分析使我们能够揭示C的存在。COD 和改性 COM 晶体表面上的officinarum成分。晶体表面吸附的组分显示出与总水提取物具有相似的活性，这表明可以将晶体改性导向 COD 形式的触发因素。在尿石症发病机制中，COD 晶体的危险性低于 COM 形式，因为它们对肾小管细胞的亲和力较低。我们的结果对于理解指导由C诱导的修饰的机制很重要。厚朴关于结晶过程。基于这些数据，在人肠上皮细胞体外模型中未观察到不良毒性作用， C . 厚朴水提取物可能是治疗尿石症的一种有吸引力的自然疗法。

介绍

尿石症是一种常见且常见的人类病理 [ 1 ]，其特点是复发率高、病理生理基础复杂、病因多[ 2 ]。尿液通常含有丰富的矿物质，容易形成结石，而在健康个体中，这种矿物质会通过减少晶体聚集而受到自然抑制 [ 3 ]。最常见的尿石症会产生草酸钙 (CaOx) 晶体。结石的形成经历了各种复杂的物理化学步骤，从晶体成核和生长开始，然后是聚集、晶体粘附在肾小管细胞上，并内化为肾上皮细胞 [ 4]。所有这些过程都发生在包含促进剂和抑制剂的复杂环境中 [ 5 ]，当晶体成核、生长并保留在肾脏内时，它们会导致肾上皮细胞受伤，从而产生结石 。高浓度的 CaOx 晶体或草酸盐本身会导致对肾细胞的毒性作用，从而诱导细胞表面改变，从而揭示肾上皮细胞粘附和/或内化晶体的附着位点[ 7-8 ]。草酸盐和/或晶体与肾小管上皮细胞之间的相互作用是结石形成的重要因素 [ 9 – 11 ]。此外，肾脏暴露于草酸盐会导致活性氧产物，随后发生脂质过氧化和细胞结构、生理学、基因表达和细胞死亡的改变 。

草酸钙 (CaOx) 晶体通常以不同的形式存在：草酸钙一水合物 (COM)、二水合物 (COD) 和稀有的三水合物 (COT) [ 14 ]。据报道，COM 晶体形式在尿石症发病机制中更危险，因为它们对肾小管细胞具有更大的亲和力 [ 15-16 ]，而 COD 形式也经常在健康受试者的尿液中发现 [ 17 ]。目前有多种针对尿石症的疗法，患者通常同时接受其中一些疗法（外科手术、药物和饮食）。对于患者的频繁复发，这些都不是完全有效的 [ 18 – 21]。尽管在此类治疗方面取得了进展，但问题仍有待解决 [ 22 ]，如果没有有效的治疗方法，植物疗法和药用植物的使用将被视为一种有价值的支持 [ 23 – 24 ] 以提供一些缓解。历史上，药用植物因其抗结石活性而被用作治疗药物 [ 2]。不幸的是，大多数这些植物的作用机制鲜为人知，因此有必要确定活性成分及其抗结石机制。多项研究发现，药用植物在尿石症的不同阶段发挥抗尿石作用，其药理作用类型也不同。这些植物还显示出镇痛和抗炎特性以及抗氧化、解痉、收敛、结晶抑制、利尿和溶石作用。还证明，药用植物可以改变尿液中的离子浓度，增加镁和柠檬酸盐的排泄，或降低钙和草酸盐的浓度 [ 2 , 24 – 26]。这些草药和植物中的大多数被用作补充和替代医学的提取物，也可作为药物研究的潜在候选药物的有趣来源。Ceterach officinarum Willd。（同义词Asplenium ceterach L 或Ceterach officinarum DC）是一种通常被称为“锈背”的蕨类植物，是属于 Aspleniaceae 的一种自生多年生草本植物，广泛分布于西欧和中欧，包括地中海地区。它的特点是根茎短，长出绿色的叶状体，叶状叶片仅在背面有橙棕色的毛状体，因此得名。它生长在碳酸盐岩的裂缝中以及石墙和砖墙之间。C. _ 铁皮地上部分广泛用于传统医学，其成分包括矿物盐、粘液、单宁、黄酮类化合物、咖啡酸和绿原酸。28 - 30 ]。其地上部分的 Tisanes 用作抗高血压和肝脏抗炎剂 [ 31 ]，而汤剂用作祛痰剂 [ 32 ]。C. _ officinarum茶在意大利南部传统上因其利尿特性和治疗肾结石而被使用，因此在该地区，它也被称为“碎石剂”[ 33 ]。据报道，地上部分的煎剂可以消除肾结石 [ 34 ] 但这种抗结石作用的实际机制仍不清楚。本研究旨在研究C的抗锂化能力。厚朴水提物在结石形成的不同阶段，其可能的机制和对人肠细胞体外模型的影响，以评估C的潜在治疗用途。officinarum用于治疗和/或预防 CaOx 肾结石。

材料和方法

化学品和试剂

使用的所有化学品均为分析级。草酸钠（Na 2 Ox，Na 2 C 2 O 4）购自ScienceLab；无水氯化钙 (CaCl 2 ) 和使用的其他常规试剂购自美国密苏里州圣路易斯的 Sigma Chemical Company。Folin-Ciocalteu 试剂购自美国加利福尼亚州 Biorad 公司。

植物材料

Ceterach officinarum Willd的干叶和地上部分。购自 OmeosalusVet（意大利）。

Ceterach officinarum水提物 (AE) 制剂

使用干磨机将干燥的植物研磨成粗粉。干燥后的细粉C. officinarum (1.5 g) 浸泡在蒸馏水 (25 ml) 中并在 72°C 下放置 30 分钟，经常搅拌。将提取物滤纸，然后在 4°C 下以 12,000 rpm 的转速离心 15 分钟。然后使用一次性过滤器单元 0.22 μm (Minisart, Biotech) 过滤上清液，滤液称为C。officinarum AE 新鲜使用或储存于-20°C；将 1 ml 的等分试样在旋转蒸发仪中冻干过夜，干燥的粉末用于测定干重 (dw)，1 ml 提取物对应于 20.6 ± 2.7 mg dw。在实验中，C的各种等分试样。使用officinarum AE。

总酚和类黄酮的定量

C的总多酚含量。officinarum AE 是通过使用 Singleton 等人 (1999) [ 35 ] 稍作修改 [ 36 ]描述的 Folin–Ciocalteu 方法分光光度法测定的]。提取物在 80% 乙醇中适当稀释；将越来越多的样品加入蒸馏水中，达到 100 μl 终体积，并与 50 μl Folin–Ciocalteu 试剂混合；使用了仅含水的试剂空白。在室温下放置 3 分钟后，加入 300 μl 20% (w/v) 的碳酸钠，并用蒸馏水将体积调至 1 ml。使用的 AE 浓度范围为 22–110 μg dw/ml。将试管涡旋混合 15 秒并在室温下静置 30 分钟以显色，然后以 10,000 rpm 的转速离心 10 分钟。在 725 nm (Uvikon 分光光度计) 测量上清液吸光度。2 = 0.9973)。测定C中总黄酮浓度的方法。officinarum AE 是一种改进的氯化铝比色法 [ 37 ] 方案，经过一些修改并针对 96 孔微量滴定板中的测量进行了调整。简而言之，将 25 μl 适当稀释的 AE 添加到 5 μl 10% AlCl 3、5 μL 1M CH 3 COOK 和 215 μl 水中。在 405 nm 处测量混合物的吸光度。所有测量一式三份进行。使用槲皮素浓度范围为 0.1 至 0.5 mg/ml (R2 = 0.9964) 获得的标准校准曲线，总黄酮类化合物表示为每克 AE 干物质中槲皮素当量的毫克数 (QE)。

氧自由基吸收能力（ORAC）测定

C的抗氧化能力。officinarum AE 通过 ORAC 方法测定 [ 38] 使用配备温控培养室 (37°C) 和自动注射泵的 Fluostar Optima Plate reader 荧光计（BMG Labtech，Offenburgh，Germany）。ORAC 测定法测量来自作为荧光探针的荧光素的荧光信号，该荧光探针在活性氧 (ROS) 存在下被淬灭。添加抗氧化剂会吸收产生的 ROS，从而使荧光信号持续存在。ORAC 检测的独特之处在于其 ROS 发生器 AAPH（2,2'-偶氮二（2-甲基丙脒）二盐酸盐）在热分解时产生过氧自由基。这种自由基通常存在于人体中，因此使这种反应具有生物学意义。使用以下混合物：200 μl 0.096 μM 荧光素钠盐在 0.075M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 中，20 μl 样品或 Trolox 或 0。075 M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 作为空白。用 40 μl 0.33 M 的 AAPH 开始反应。在 485 nm 处读取荧光。和 520 纳米 em。直到彻底灭绝[38 ]。每次使用 Trolox 标准品在 0.075 M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 中制作校准曲线。ORAC 值表示为 μmol Trolox 当量 (TE)/g dw。

DPPH自由基清除试验

使用稳定的自由基DPPH • (2, 2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl) 和Saltarelli [ 39 ]中报道的DPPH •自由基清除试验评估抗氧化活性。

简而言之，将 850 μl 新鲜制备的 100 μM DPPH •乙醇溶液添加到 150 μl 用 80% 乙醇适当稀释且浓度为 5.95–96.5 μg dw /ml 的样品中。在室温下 10 分钟后，测量 517 nm 处的吸光度降低。乙醇用作空白，清除能力计算为 DSA（DPPH 清除活性）% = [（A 517 nm空白 - A 517 nm样品）/A 517 nm空白] x 100。EC 50计算为提供 50% 自由基清除活性所需的提取物干重浓度 (μg/ml)。

蛋白质测定

基于 Bradford 染料试剂（考马斯亮蓝 G-250），使用 BSA 作为标准，通过 Bio-Rad 蛋白质测定法对蛋白质浓度进行量化 [ 40 ]。

高效液相色谱分析

样品在配备有 Alliance HT 2795 高效液相色谱 (HPLC)、2996 光电二极管阵列 (PDA) 和微量 LC/MS ZQ 2000 检测器的 Waters 仪器中进行如下分析。使用 C18 色谱柱 LiChroCART (250 × 4 mm)，粒径为 5 μm。流动相由乙腈（溶剂 A）和 0.1% 甲酸水溶液（溶剂 B）组成。梯度变化如下：0-4 分钟从 5% A 到 15% A，4-20 分钟到 18% A，20-35 分钟到 93% A，35-40 分钟到 100% A。总运行时间是40分钟。进样量为 50 μl，流速为 0.8 ml/min。记录从 210 到 420 nm 的紫外光谱。电喷雾电离 (ESI) 在 100-700 amu 范围内以正离子和负离子模式操作。毛细管电压设置为 3 kV，源温度设置为 100°C，去溶剂化温度设置为 300°C。锥形和去溶剂化氮气流量分别为 50 和 500 l/h。使用 MassLynx 4.1 (Waters, Milford, USA) 处理数据。通过与分析标准品进行比较来鉴定产品。

细胞培养和活力

Caco-2 细胞如 Tunisi 等人所述进行分化。[ 41 ]。简而言之，将细胞以 5×10 4细胞/孔接种在 48 孔板中，并在 37°C 下在补充有 10% 牛胎血清 (Life Technologies)、青霉素 (50 单位/ ml) 和链霉素 (50 μg/ml) (Life Technologies)，在 95% 空气-5% CO2 的气氛中充气。培养 20-21 天后，分化的细胞最后用不同浓度的C处理。officinarum AE（250、500 和 1000 μg dw/ml）24 小时。如 Palomba 等人所述，通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 的还原来评估细胞活力。[ 42]。处理 24 小时后，在孵育期结束前 2 小时将 MTT (25 μg/ml) 直接添加到培养基中。用磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich）洗涤细胞两次，并通过测量二甲基亚砜提取物在 595 nm 处的吸光度来确定细胞 MTT 还原酶活性。结果表示为处理过的细胞与未处理过的细胞的 MTT 降低活性的百分比。

CaOx 结晶分析

库存解决方案

储备溶液新鲜制备如下：Sol A 10.0 mM 氯化钙 (CaCl 2 ) 在 200 mM 氯化钠 (NaCl) 和 10 mM 乙酸钠中，pH 5.7；溶胶 B 1.0 mM 草酸钠 (Na 2 C 2 O 4 ) 溶于 200 mM 氯化钠 (NaCl) 和 10 mM 乙酸钠，pH 5.7。两者均通过 0.22 μm 醋酸纤维素过滤器过滤 [ 43 ]。为储备溶液选择 5.7 的 pH 值是在患有尿石症问题的受试者的第一次晨尿中经常观察到的 pH 值 。

分光光度测量

在存在和不存在C的情况下进行 CaOx 结晶。厚朴AE。如 Mittal 等人所述，使用光密度的时间过程测量来研究 CaOx 的结晶。溶液 A 和 B 保持在 37°C。随后在 3ml 玻璃比色皿中加入：950 μl Sol. A，在 100 μl 最终体积中加入蒸馏水和 950 μl Sol B 逐渐增加的 AE 等分试样，以达到 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐的最终测定浓度。使用的浓度范围为 125–1000 μg AE dw/ml 反应混合物。连续搅拌最终溶液并保持在37°C。在 620 nm (Uvikon 分光光度计) 的吸光度下测量晶体悬浮液的浊度。通过在 50 分钟内每 30 秒记录一次吸光度来获得晶体形成的速率。AE 对 CaOx 结晶的影响以蒸馏水为空白进行了评估。所有结晶实验至少一式三份进行。

光学显微镜观察

在存在和不存在C的情况下，通过光学显微镜观察到 CaOx 结晶。厚朴AE。在 24 孔板的孔中依次放置：475 μl CaCl 2原液、逐渐增加等分的 AE（最终体积为 50 μl 的蒸馏水）和 475 μl Na 2 C 2 O 4原液，以便分别获得 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐的最终浓度。使用的提取物浓度范围为 1 至 1000 μg dw/ml。含有 50 μl 蒸馏水而不是 AE 的样品用作参考对照系统。将板置于室温下，然后通过光学显微镜在不同的放大倍数下观察（Olympus ) 并根据晶体大小、形状和丰度进行定性分析。图片由 ToupTek ToupView 版本处理。3.7.

X 射线粉末衍射 (XRPD) 分析

如“CaOx 结晶分析”中所述制备并保持在室温下的储备溶液用于表征在存在和不存在C的情况下产生的 CaOx 晶体的结晶相。XRPD 的officinarum AE。为此，依次放置：950 ml CaCl 2溶液、100 ml 蒸馏水或 EA 和 950 ml Na 2 C 2 O 4溶液，最终浓度分别为 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐。用玻璃棒轻轻搅拌反应混合物并在室温下放置150分钟。使用 0.45 μm 硝酸纤维素膜过滤器过滤混合物。获得的粉末在室温下干燥并用于XRPD分析。

XRPD 矿物学分析使用 Philips X'Change PW 1830 衍射仪（Cu-Kα 辐射）进行。通过轻轻手工粉碎 CaOx 晶体来制备随机取向的粉末。然后将粉末侧装到铝支架中以检查未取向的粉末，随后以 0.02° 步长进行分析，计数时间为 1 秒/步，从 2° 到 65° 2θ。分析条件为 35 kV 加速电位和 30 mA 灯丝电流。所有主要峰都在细化中被索引，石英作为内标。

ESEM分析

在“光学显微镜观察”部分中报告的 CaOx 晶体在室温下沉淀在碳盘上 24 小时，然后通过配备能量色散 X 的环境扫描电子显微镜 (ESEM) FEI Quanta 200 FEG 进行研究用于微量化学分析的射线光谱仪 (EDS)。操作条件为 30 kV 加速电压、10 mm 工作距离、0° 倾斜角和可变光束直径。ESEM 在低真空模式下使用，样品室压力设置为 0.80 至 0.90 mbar。使用背散射电子检测器获得图像。在存在和不存在C的情况下，在 CaOx 结晶测定中产生的晶体的形态学数据（数量、大小和形态）。厚朴通过对几个 ESEM 图像中可见的所有晶体的准确观察和测量来收集 AE。这些图片是根据两个主要标准选择的：（i）代表每个调查样本的总面积，以及（ii）进行大量测量。

晶体的 AFM 表征

还通过原子力显微镜（AFM）研究了晶体形状和尺寸。简而言之，将如上所述获得的 50 μl CaOx 晶体分层在玻璃表面上并通过氮气流干燥。本研究使用 XE-100 原子力显微镜（AFM；PARK Systems Inc.）；该仪器配备了由 XEP 1.8.1 软件控制的 50μm 扫描仪。AFM 设置为非接触模式，X-Y 阶段处于闭环和高压模式。Z 扫描仪设置为闭环和高压模式，分辨率设置为 1.8Å。大图像的速度扫描为 0.25Hz，1x1μm 采集的速度扫描为 1Hz。本研究中使用的尖端是 NCHR 类型，标称弹簧常数为 42 N/m，典型谐振频率在 250 和 300kHz 之间。数据采集在受控温度的空气中进行。除了地形之外，还获得了幅度和相位信号。振幅信号被用作 Z 反馈电路的独特驱动，从而使相位信号完全取决于表面的化学和纳米机械特性。相位信号评估（相位检测显微镜 PDM）是通过使用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的，每种条件分析了大约 25 张图像。使用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 分析 AFM 图像。相位信号评估（相位检测显微镜 PDM）是通过使用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的，每种条件分析了大约 25 张图像。使用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 分析 AFM 图像。相位信号评估（相位检测显微镜 PDM）是通过使用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的，每种条件分析了大约 25 张图像。使用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 分析 AFM 图像。

溶解来自C的晶体表面粘附组分。铁皮水提物

在玻璃烧杯中依次放置：475 ml Sol A、50 ml 蒸馏水或 EA 和 475 ml Sol B，如前所述，最终浓度分别为 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐。用玻璃棒轻轻搅拌反应混合物并在室温下放置150分钟。除 100 ml 外，混合物使用 0.45 μm 硝酸纤维素膜过滤器过滤。从过滤器表面收集晶体并添加到未过滤的 100 ml 中。将该悬浮液以 5,000 rpm 离心 10 分钟并弃去上清液。将沉淀重新悬浮在 50 ml 2 M HCl pH 0.6 中，通过对草酸盐的作用使 COD 晶体溶解。将晶体表面粘附组分装入具有 3,500 kDa MWCO（截留分子量）的透析管中，并用蒸馏水透析过夜。将透析样品的等分试样干燥过夜并用于测定干重（0.2 mg dw/ml）。将干燥的粉末适当地重新悬浮在蒸馏水中，用于随后的活性表征分析。

统计分析

数据表示为至少三个独立实验的平均值±SD，并使用单因素方差分析进行分析，然后使用 Kruskal Wallis 检验进行多重比较分析或非参数 Mann-Whitney U 检验。P <0.05被认为是显着的。AFM 样品数据之间的统计比较采用 Dunnett 的多重比较检验，仅报告与对照样品的比较。细胞实验中的统计分析通过双向方差分析进行，然后进行事后Bonferroni 测试。P < 0.05 的置信水平用于统计显着性。

结果

枸杞水提物的蛋白质含量、总酚和抗氧化能力

C的蛋白质含量。通过 Bradford 的方法 [ 40 ] 获得的officinarum AE为 52.91 ± 3.8 mg/g AE dw。总酚的量为 136.94 ± 7.6 mg/g AE dw，黄酮类化合物的量为 46.12 ± 2.2 mg/g AE dw。C的抗氧化活性。使用 ORAC [ 38 ] 和 DPPH •自由基清除测定法 [ 39 ] 测量了officinarum AE 的自由基清除能力。

ORAC 值为 2798 ± 14.1 μmolTE/g AE dw。

据报道图。1, C. _ officinarum AE 具有 DPPH 剂量依赖性自由基清除活性，显示 DPPH 自由基抑制百分比范围从 5.95 μg dw/ml 测定混合物时的 11.26 ± 1.54% 到 96.5 μg dw/ml 测定混合物时的 85.0 ± 1.6%。线性范围为 5.95–49 μg dw /ml，IC 50值为 35.46 μg/ml。

图。1 C DPPH 剂量依赖性自由基清除活性。厚朴AE。

结果是超过 3 次不同实验的平均值 ± SD。根据 Kruskal Wallis 检验和 Dunn 后检验推断，每个样本的中值都不同于其他样本 (p<0.05)。

高效液相色谱分析

50 μl C. 通过 HPLC 分析officinarum AE，如“材料和方法”部分所述配备。通过与分析标准品比较，在 HPLC 色谱图中鉴定了产物。据报道图2，色谱图的主峰（保留时间8.97 min）为绿原酸。

图2C的色谱图。厚朴AE。

从获得的色谱图中，主峰被确定为绿原酸。

C的影响。人肠细胞上的厚朴AE

使用表达人体肠道细胞形态学和生物学特征的 Caco-2 细胞 [ 45 ]，无C的有害影响。观察到officinarum AE。仅在最高剂量下观察到轻度毒性（250 μg dw /ml：97.4±7.5%；500 μg dw /ml：98.7±6.5%；1000 μg dw /ml：76.6 ±5.2%*；结果代表平均值 ± SD来自三个独立的实验，每个实验一式四份；*p < 0.05 与未处理的细胞相比）。

分光光度结晶测量

通过用作浊度估计的620nm (A 620nm )处的吸光度测量形成的晶体数量。在该测定系统中，A 620nm是衡量每单位体积颗粒浓度的良好指标，因此 A 620nm的增加主要反映了颗粒数量随时间的增加。因此，A 620nm的最大增加斜率，称为成核斜率 (S N ) 并由线性回归分析确定，主要代表新粒子形成的最大速率，从而表示晶体成核。对照实验中 A 620nm的时程测量遵循先前报道的典型曲线 [ 26 , 46 ]。如图所示图 3, C. _ officinarum AE 对 CaOx 结晶有促进作用；AE 产生的成核刺激百分比，计算为 [(S N AE - S N c) / S N c] × 100（其中“c”代表对照）随着提取物浓度的增加而以剂量依赖性方式增加从 125 到 1000 μg AE dw/ml。

图 3C产生的成核刺激百分比。厚朴AE。

结果是超过 3 次不同实验的平均值 ± SD。根据 Kruskal Wallis 检验和 Dunn 后检验推断，每个样本的中值都不同于其他样本 (p<0.05)。在对照实验中，在达到 A 620的最大增加后，由于晶体聚集 [ 46 ] 而在存在C的情况下，尽管连续搅拌，但仍观察到吸光度逐渐下降。officinarum AE 没有观察到这种下降。由于C的存在，对照样品中的晶体聚集和这种现象的完全抑制。ESEM分析清楚地显示了officinarum AE（S1图）。

光学显微镜观察

CaOx 在存在和不存在C的情况下结晶。如“材料和方法”部分所述，还通过光学显微镜分析了officinarum AE。在对照系统中，培养 24 h 后获得的显微照片显示形成了两种类型的 CaOx 晶体：具有单斜棱柱形或孪晶形的大量 COM 晶体，只有少数具有典型双锥体形状的 COD 晶体（图 4A 和 4B）。COM 和 COD 晶体都很大，COM 呈现出大致斜方结构，具有高度多面的 {100} (图 4A) 和 {010} 人脸 (图 4B）。添加C。将厚朴提取物加入到反应混合物中会导致所产生晶体的结构、数量和大小发生变化。AE 浓度已经达到 0.9–2 μg dw/ml (图 4C) 形成的粒子数量略多，其中大部分仍然是 COM。与对照组相比，这些 COM 晶体更小，数量几乎减半；然而，{100} 和 {010} 双晶面由于宏观台阶的存在而高度刻面，并且更小、更不规则的形状表明正在进行的生长动力学。随着提取物浓度增加到 15-30 μg dw/ml (图 4D)，COM晶体数量更多，体积更小，更薄，形状更规则，光滑的{100}面上有明显的凹陷，而COD晶体仍然很少见，中等大小。如图所示图 4E，在 60–125 μg dw/ml COD 晶体存在时，仍然是中等大小，变得更多，而 COM 晶体更多，更小，更薄，具有圆形边缘，有时呈哑铃形或新月形，可能是由于到光滑的{100}面上的深深凹陷。在高达 130–200 μg dw/ml (图 4F），晶体数量显着增加，几乎都是中小型COD晶体，只有偶尔的COM晶体。C浓度较高。officinarum AE 500 至 1000 μg dw/ml (图 4G 和 4H) 显示了 COD 形式的唯一存在。随着提取物浓度的增加，形成的 COD 晶体的数量以剂量依赖性方式增加，同时观察到 COD 的大小逐渐减小，最高浓度导致大量微小晶体的形成。

图 4在不存在和存在C的情况下生长的 CaOx 晶体的光学显微照片。officinarum AE 浓度增加。

(A) 和 (B) 控制；(C) AE，2 μg dw/ml；(D) AE，30 μg dw/ml；(E) AE，125 μg dw/ml；(F) AE，200 μg dw/ml；(G) AE，500 μg dw/ml；(H) AE，1000 μg dw/ml。所有面板的放大倍数为 400 倍。

XRPD分析

XRD 测量揭示了在存在和不存在C的情况下产生的不同类型和数量的 CaOx 晶体的结晶。厚朴AE。在不存在 (a) 和存在不同浓度 (b, c, d) C的情况下生长的 CaOx 晶体的代表性 XRD 衍射图案。officinarum AE 显示在图 5. 无C时 CaOx 晶体的主要反射。药用AE (图 5A) 位于 2 theta 14.81、24.41 和 29.98°，分别归因于一水草酸钙 (COM、单斜晶系、空间群P 2 1 / c ) 的 {100}、{040} 和 {200} 平面。对于在 1000 μg dw/ml C存在下获得的 CaOx 晶体。药用AE (图 5D) 在 14.21、19.95、32.05、37.31 和 40.20° 处的强反射被分配到草酸钙二水合物（COD、四方、空间群）的 {200}、{211}、{411}、{103} 和 {213} 平面I 4/ m )，分别。的衍射图案（b）和（c）图 5与在 200 和 500 μg dw/ml C存在下获得的晶体有关。officinarum AE，分别显示 COM 和 COD 晶体的存在。使用相对峰高/面积比例的半定量估计表明，在 200 μg dw/ml C存在下，COM 晶体 (80 vol.%) 优于 COD 晶体 (20 vol.%) 。药用AE (图 5B)，而随着C的增加 (500 μg dw/ml) 的量，它们往往会变得等价（COM 的 60 vol.% 和 COD 的 40 vol.%）。药用AE (图 5C)，在 1000 μg dw/ml C时仅检测到 COD 晶体。药用AE (图 5D）。

图 5草酸钙一水合物 (COM) 和二水合物 (COD) 晶体的 XRPD 衍射图。

晶体在C不存在和存在的情况下生长。officinarum AE：（a）在没有 AE 的情况下获得的 COM 晶体。(b, c) 在 AE 200 μg dw/ml (b) 和 500 μg dw/ml (c) 存在下获得的 COM 和 COD 晶体；(d) 在 AE 1000 μg dw/ml 存在下获得的 COD 晶体。报告主要反射的 D 值和指数。还显示了 COM（上灰色条，参考代码 00-016-0379）和 COD（下灰色条，参考代码 01-075-1314）晶体的标准衍射光谱以进行比较。

ESEM分析

使用文献 [ 47-49 ]中可用的晶体学特征（习性、晶面之间的角度、晶体对称性等）描述沉淀物的晶相和形态。晶体的形态清楚地表明，各种习性（形状和形式）与从 XRD 数据评估的草酸钙的水合状态密切相关。根据 ESEM 观察 (图 6)，几乎所有 CaOx 晶体在没有C的情况下沉淀。officinarum AE 是一水草酸钙 (COM) 单晶，具有板状习性。它们主要呈现面形松果体{100}、{010}和棱镜。pinacoids {100} 和 {010} 通常是主要形式，分别具有菱形和平行四边形的形状。这些COM单晶的平均尺寸为长8.2 μm（{001}维）、宽4.4 μm（{010}维），一般高1-2 μm（{100}维）。在这些主要的形态类型中，还有过渡形态和穿透孪生。形成的穿透孪晶从 {010} 和 {100} 面成核（图 6A 和 6B）。这些晶体具有良好的刻面，具有 {100}、{010} 和 {121} 面。还观察到从渗透到多孪生、超孪生和很少到超孪生聚集体的转变（图 6C 和 6D）。超/超双胞胎的晶体习性倾向于呈现圆润的 {100}/{121} 边缘（图 6D）。在没有C的情况下，二水草酸钙 (COD) 晶体非常罕见。officinarum AE，而未检测到三水合物 (COT) 或无定形相。

图 6在不存在 (ad) 或存在 (e, f) 不同浓度C的情况下获得的各种形态类型 COM 和 COD 的扫描电子显微照片。厚朴AE。(a) 从 [ 1 ] 方向观察的孪晶 COM 晶体。(b) 单晶和双晶 COM 晶体。(c) 从 [ 10 ] 方向观察的双孪晶 COM 晶体。(d) 超孪晶和超孪晶 COM 晶体，形成花状聚集体。(e) 在 500 μg dw/ml AE 存在下的单个四方双锥 COD 晶体；(f) 在 1000 μg dw/ml AE 存在下，单方四方 COD 晶体和扁平 COD 晶体的小穿透孪晶。相反，在C浓度增加的情况下，晶体形态发生了显着变化。药用AE (图 6E500微克干重/毫升；图 6F1000 μg dw/ml AE）。析出的 COM 的总体积急剧减少直至消失，而 COD 晶体成为排他性物种的优势。COD晶体的典型形式如图所示图 6E 和 6F. 它们具有 COD 的经典晶体习性，由以 {101} 面为主的单个四方双锥体为代表，沿晶体 c 轴的平均边长约为 6.5 μm，边长约为 1 μm（图 6E）。所有这些双锥体的特点是没有棱柱形 {100} 面，使晶体具有非常扁平的形状。在更高放大倍数的 ESEM 图像中（图 6F)，局部穿透孪晶的形成在较小的扁平四方双锥体中很明显。

观察在不存在和存在不同浓度C的情况下获得的不同 CaOx 沉淀物的 ESEM 图像。药用AE (图 7)，晶体尺寸的逐渐减小伴随着它们的数量的增加明显出现。没有C时晶体的平均尺寸 (COM) 。officinarum AE 为 8.2 μm（长度）。在 200 μg dw/ml 的C存在下，晶体尺寸 (COD) 略有增加。officinarum AE（平均长度为 9.93 μm），而从 500 μg dw/ml 通过时会发生显着的尺寸减小。（平均长度 6.43 μm）至 1000 μg dw/ml（平均长度 3.69 μm）的 AE。这种晶体尺寸的减小伴随着每单位面积晶体总数的显着增加，在没有C的情况下平均达到 47 个晶体/单位面积。厚朴在 AE 的最大浓度 (1000 μg dw/ml.) 存在下，AE 达到 393 个晶体/单位面积。

图 7

在不存在或存在不同浓度C的情况下获得的 CaOx 晶体的扫描电子显微照片（上）和形态/数量数据（下）。厚朴AE。

(A) 控制；(B) 200微克干重/毫升；(C) 500 μg 干重/毫升；(D) 1000 μg dw/ml AE。

AFM（原子力显微镜）分析

样品的形貌图像显示，随着C含量的变化，层状颗粒的尺寸明显减小。officinarum AE 从 1 μg dw/ml 到 1000 μg dw/ml (图 8）。

图 8随着C增加的 CaOx 晶体的代表性形貌图像。药用AE 浓度。

(A) 和 (B) 对照样品，(C) 1μg dw/ml AE，(D) 5μg dw/ml AE，(E) 10μg dw/ml AE，(F) 50μg dw/ml AE，(G) 100 μg dw/ml AE 和 (H) 1000μg dw/ml AE。最大和平均高度以及晶体体积的测量表明，添加 AE 会改变 CaOx 颗粒的形状和尺寸。事实上，描述符值的所有分布都以剂量依赖的方式向下移动，如图所示图 9. 最大和平均高度参数的分析表明，只有用 1 μg dw/ml、50 μg dw/ml 和 1000 μg dw/ml AE 处理的样品与对照样品有显着差异，而体积分析显示有显着的统计学差异在对照样品和 50 μg dw/ml、100 μg dw/ml 和 1000 μg dw/ml AE 处理的样品之间。最大和平均高度取决于 CaOx 晶体的取向，因此，它们与对照样品的差异小于提供更一致结果的体积数据的差异。

图 9

通过 AFM 成像获得的最大高度、平均高度和体积的散点图。

采用 Dunnett 的多重比较检验来评估差异。仅报告与对照的比较。* P<0.05；*** P < 0.01。

相位信号分析还揭示了对照与 50 μg dw/ml、100 μg dw/ml 和 1000 μg dw/ml AE 处理的 CaOx 溶液之间的显着统计学差异（图 10）。这表明当 AE 存在时，表面的化学物理性质会发生变化。这可能是由于 AE 组分粘附到晶体表面，从而改变了表面化学性质。

图 10

通过相位 AFM 成像获得的相位数据散点图。

采用 Dunnett 的多重比较检验来验证样品之间的统计差异，并且只报告与对照的比较。*** P < 0.01。

在图 11三个样品的代表性相位图像显示对照样品表面不存在球状结构（图 11A)，而它们是在 50 μg dw/ml C中观察到的。officinarum AE 样品在 1000 μg dw/ml 样品中尺寸增加（图 11B 和 11C）。

图 11 AFM 三相图像的表面图案。

该图显示了 AE 组分对 CaOx 晶体表面的可能影响。与对照样品 (A) 相比，在 50 μg dw/ml C存在下。officinarum AE (B) 在存在 1000 μg dw/ml C的情况下，呈小球状，尺寸增加。厚朴AE (C)。奇怪的现象是 50 μg AE 样品（与对照相比相位结果增加）与 100 μg 和 1000 μg AE 样品（与对照相比相位信号显着降低）之间的相位变化不同，如图所示图 10. 我们假设这种现象不仅取决于C可能的表面附着力。officinarum AE 成分，但也影响其对晶体生长方向的影响，从而暴露出不同的表面化学基团，这可能会改变相位信号。事实上，通过幅度信号研究，可以精细地研究表面的纳米和亚纳米组织 [ 50 ]，并且我们能够表示依赖于C的 CaOx 亚结构的改变模式。药用AE 浓度 (图 12）。可能在 50μg dw/ml 时，相位信号主要受改变的 CaOx 亚结构取向的影响，而在较高浓度时C的吸附和相互作用。具有晶体表面的officinarum AE 成分变得占主导地位。

图 12 FF 变换幅度信号的彩色增强代表性图像。

红色箭头表示没有 AE 吸附的 CaOx 晶体的纳米域。可以观察到依赖于C的表面结构的变化。officinarum AE 浓度增加，这可能会影响晶体生长。(A) 对照样品，(B) 50 μg，(C) 100 μg 和 (D) 1000 μg dw/ ml C。officinarum AE 分别。在 (C) 中，白色箭头表示可能的 AE 组分吸附。

晶体表面粘附组分对 CaOx 结晶的影响

为了验证晶体表面组分的特异性结合（如材料和方法部分所述溶解）影响整个C观察到的 CaOx 结晶的改性的假设。officinarum AE，进行光学显微镜观察。

CaOx 结晶显微照片在不存在和存在这些组分的情况下以增加的浓度孵育 24 小时后显示，与对照相比，它们诱导晶体结构、数量和大小的改变（图 13A 和 13B）。浓度已达到 1.2 μg dw/ml (图 13C) 可以验证 COM 角的轻微倒圆；这种趋势在浓度增加到 2.3 μg dw/ml 时更加突出（图 13D) 和 4.7 μg dw/ml (图 13E 和 13F)，晶体几乎都是中大型 COD。然而，尽管很少见，但仍然观察到一些圆形的 COM 晶体，非常厚且呈孪晶形式。从 9.4 μg dw/ml (图 13G) 高达 18.7 μg dw/ml (图 13H) 与 COD 表格的唯一存在有关。这些 COD 晶体的数量逐渐增加，尺寸相应减小，呈剂量依赖性。

图 13 在不存在和存在C的情况下生长的 CaOx 晶体的光学显微照片。officinarum溶解的组分在增加的浓度。

(A) 和 (B) 控制；(C) 1.2 微克干重/毫升；(D) 2.3 微克干重/毫升；(E) 和 (F) 4.7 μg dw/ml；(G) 9.4 微克干重/毫升；(H) 18.7 微克干重/毫升。所有面板的放大倍数为 400 倍。

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讨论

肾结石仍然是一个全球性的公共卫生问题，因为它影响了世界 1-20% 的成年人口。CaOx 是肾结石的主要成分，CaOx 晶体沿泌尿道沉淀，依赖于过饱和，代表了结石形成的主要条件 [ 26 ]。由于晶体滞留也已被证明是结石生成的关键因素 [ 6-11 ]，因此干扰 CaOx 结晶和滞留过程可为预防和控制复发性结石形成提供有用的治疗方法。越来越多的证据 [ 33 , 34 ] 表明C的有益作用。officinarum水提物 (AE) 用于治疗肾结石，但尽管如此，人们对C的实际机制知之甚少。officinarum抗结石作用。此外，除了尿液过饱和的条件和有利环境的出现外，结石的形成还有许多步骤，不同的抗尿石植物在尿石症的不同阶段发挥作用。特别是，许多植物提取物通过防止氧化应激的发生而具有明显的抗锂活性 [ 51 – 53]。一种解释与 COM 乳头状结石的形成有关，占泌尿系结石的 13%，而在肾腔中形成的 COM 结石占肾结石的 16%。COM 乳头状结石的发展与肾乳头的初始上皮下钙化有关，羟基磷灰石沉积取决于预先存在的涉及活性氧和氧化应激的损伤 [ 51 , 53 ]。酚类化合物，如黄酮类化合物、酚酸和单宁，被认为主要负责植物的抗氧化能力。

我们的结果证实了C . officinarum AE 也是一种丰富的抗氧化剂来源，通过 DPPH •自由基清除试验评估具有重要的抗氧化活性。图。1）。分光光度法测定总酚类和黄酮类化合物的含量，以及 HPLC 分析（图2)，表示C . officinarum水提取物包括升高水平的酚类成分，因此这些植物化学物质对C . 不能排除officinarum AE 抗结石活性。我们的数据证明了C的主要影响。officinarum水提取物对体外诱导的草酸钙结晶动力学和晶体形态的影响，对保留步骤有显着影响，指出在肾结石形成和/或消除中的关键作用。

更具体地说，在分光光度分析中，随着提取物浓度的增加，A 620nm的增加表明晶体数量的增加与剂量相关，因为 A 620nm高度依赖于新晶体的生成，即成核过程本身（图 3）。然而，在较小程度上，A 620nm也与晶体尺寸有关[ 26 , 46 ]。事实上，光学显微镜观察表明添加C . officinarum AE 对结晶系统的影响不仅抑制了 CaOx 晶体的沉淀，而且随着提取物剂量的增加，实际上诱导了更多的晶体，尽管产生的晶体逐渐小于对照样品中的晶体，呈剂量依赖性。图 4）。此外，在C存在下，由分光光度计测量和在 ESEM 分析中观察到的对照样品中的晶体聚集受到抑制。officinarum AE（S1 图）。这些效果已经足以在预防结石症、抑制晶体生长和聚集以及随后抑制结石形成方面提供显着优势，从而更容易随后通过尿道消除非常小的分散晶体。然而，我们在C的作用中获得了额外的重要结果。officinarum AE 在预防结石症中的作用。首先，我们的微观分析证实了C . 厚朴AE 改变 COM 晶体形态：在 60-120 μg dw/ml 的范围内，AE 诱导 COM 晶体的形成，其特征是 {100} 表面凹陷和圆角界面角，促进 COM 从六角形转变为球形形状，以一种让人想起柠檬酸盐和 Mg 2+ [ 54 ] 以及各种其他植物提取物（包括Terminalia arjuna和 cystone [ 55 ] ）的早期报告的方式。也是Phyllantus niruri的 AE ，一种在巴西民间医学中广泛食用的大戟科植物，并因其在治疗尿石症中的有益作用而被广泛研究 [ 56]，当通过我们的实验方案进行测试时，在 CaOx 一水合物晶体中引起了类似的形状修改（S2 图）。特别是关于柠檬酸盐，一种众所周知的草酸钙结石形成抑制剂，Shang 等人。[ 57 ] 表明，CaOx 结石患者口服柠檬酸钾导致尿液 COM 晶体表面出现凹陷，从而呈现凹形，边缘圆钝，同时尺寸减小。据报道，这些圆形 COM 晶体在热力学上不太稳定，与六角形 COM 晶体相比，它们对细胞肾膜的亲和力降低，对这些细胞的粘附性更低 [ 55 ]。这些形状修饰的 COM 晶体可以更容易地通过尿路排泄，从而防止肾结石的产生。

其次，更有趣的是，我们通过光学显微镜和 ESEM 的观察结果（图6和7) 突出显示C。浓度为 120-500 μg dw/ml 的厚朴AE 促进草酸钙二水合物而非一水合物晶体的形成，因此最终，在 500-1000 μg dw/ml 之间，仅观察到 COD，并且这些晶体逐渐变小，在剂量依赖性方式。与 COM 晶体相比，COD 晶体不太可能粘附和保留在肾细胞表面，因此对肾小管上皮细胞的损伤较小。在Phillantys niruri水提取物存在下，我们观察到 COM 晶体显着减少，同时 COD 晶体增加（ S2 图）。还有尚等人[ 57] 观察到柠檬酸盐将 COM 转化为专门的 COD 晶体，并将这一事件归因于 Ca 2+离子与柠檬酸盐络合形成具有高溶解度的螯合物。这种螯合作用可以缓慢溶解导致出现凹陷的晶体。溶解的Ca 2+离子不断地重新沉积在CaOx 晶体表面，这种连续的溶解-沉积会引起COM 的形态变化并转化为COD。我们通过 AFM 进行的额外观察（图8–10) 进一步证实了C . officinarum AE 对形态学参数和使用光学显微镜和 ESEM 描述的 COM 和 COD 晶体总数的剂量依赖性影响。此外，基于 AFM 分析的这些结果，我们能够证明，与对照样品相反，在C存在下获得的晶体。officinarum AE 在其表面呈现出小球状形状，这些形状以剂量依赖性方式变大（图 11）。这些数据强烈暗示了C的吸附。晶体表面上的officinarum AE 组分是导致所述晶体修饰的可能因素。然而，样品 50 μg dw/ml AE 与样品 100 μg 和 1000 μg dw/ml AE 之间不同的相位变化表明C . officinarum AE 不仅通过其组分相互作用（一种似乎在较高浓度下占主导地位的机制）发挥上述作用，而且在较低浓度下，似乎立即移动特定的表面化学基团，从而改变相位信号（图 10); 它可能导致影响晶体生长方向，这可以从重构的 CaOx 晶体表面的纳米和亚纳米结构中合理地推断出来（图 12）。

这些结果与其他作者 [ 58 – 59 ] 先前 AFM 研究的结果一致，这些研究涉及特定调节剂吸附在晶体表面对 CaOx 晶体生长的影响。基于 AFM 成像评估，Guo 等人。[ 58 ] 证实了阴离子聚合物如聚天冬氨酸 (polyD) 和聚谷氨酸 (polyE) 通过其官能团（分别为天冬氨酸和谷氨酸残基）在不同的 COM 晶体表面上的吸附不同地改变了吸附机理COM 晶体生长似乎发生了。此外，De Yoreo 等人。[ 59 ] 通过 AFM 分析验证了晶体和生长调节剂如柠檬酸盐和骨桥蛋白 (OPN) 之间的特定相互作用的关键作用。关于吸附在晶体表面上的假定 AE 活性成分的存在（图 11) 我们决定使用 COD 晶体的增溶程序将它们分离出来，在这些晶体上这些成分更明显。这样的策略使我们能够获得一个与 AE 的活动非常相似的样本。在不存在和存在增加浓度的这些组分的情况下孵育 24 小时后获得的 CaOx 结晶显微照片表明，事实上，它们通过更圆润的 COM 诱导了典型形式的 COM 晶体的结构、数量和大小的改变晶体，以剂量依赖性方式完全转化为数量增加而尺寸逐渐减小的 COD 晶体（图 13）。总之，在这项体外研究中，我们表明C. officinarum AE 除了具有高抗氧化能力外，还是一种有效的 COM 生长和聚集抑制剂。此外，它在刺激晶体成核方面非常有效，导致 COM 晶体数量显着增加，相应的 COM 晶体尺寸明显减小，变得越来越薄、越来越圆、越来越凹；这些较小且形状经过修饰的 COM 晶体被认为粘附性较差，更容易通过尿路排泄，从而防止肾结石的产生。更重要的是，C . 厚朴. 超过低浓度阈值的 AE 促进草酸钙二水合物而不是一水合物的形成，以剂量依赖性方式进一步减小 COD 晶体的大小。由于 COD 晶体的吸附能力最低，本文报道的结果可能强烈支持C的保护作用。officinarum AE 对肾结石的形成。我们验证C吸附的能力。修饰的 COM 和在 AE 浓度升高的情况下产生的 COD 晶体表面上的officinarum活性成分表明了一个假设的触发因素，该因素可能将晶体修饰导向 COD 形式，如图所示图 14.

图 14

增加C剂量诱导的 CaOx 晶体形态变化的假设模型示意图。C. officinarum AE。

该图表示来自C的活性成分的逐渐粘附。晶体表面上的officinurum作为一个假设的触发因素，指导从 COM 到 COD 形式的晶体修饰。(A)：控制；(BD) 逐渐增加C的剂量。药用AE。

基于这些数据，以及对人类分化的 CaCo 细胞系没有显着毒性，该细胞系被广泛用作肠上皮屏障的模型 [ 41 ]，C . 厚朴。水提取物可以代表一种有吸引力的尿石症天然替代疗法。

在不久的将来，我们打算识别和表征这种晶体生长调节剂，为此，我们已经开始了进一步的广泛研究，以帮助我们最终阐明C的积极作用和益处的潜在机制。铁皮治疗尿石症。

S1 图

CaOx 晶体的扫描电子显微照片。

在不存在 (A) 或存在 (B) 1000 μg dw/ml C的情况下获得晶体。厚朴AE。通常在对照样品 (A) 中观察到晶体聚集的证据，而在存在提取物 (B) 时它们完全不存在。(TIF)