科研 |南大:(IF:24)牙周炎可能通过唾液微生物群诱导肠道菌群失调(国人佳作)

编译：微科盟小木，编辑：微科盟小编、江舜尧。

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导读  

本研究旨在确定牙周炎是否通过唾液微生物的入侵引起肠道菌群失调。首先，收集牙周健康受试者(PH组，n=16)和严重牙周炎患者(SP组，n=21)的粪便和唾液样本，并通过16S rRNA测序进行分析。PH组和SP组之间的粪便和唾液微生物群均存在显著差异。值得注意的是，在SP组的粪便样本中观察到更多唾液源性微生物。然后，将剩余的唾液微生物移植到C57BL6/J小鼠体内(C-PH组和C-SP组)，发现两组的肠道微生物群组成存在显著差异，卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)和梭杆菌属(Fusobacterium)在C-SP组中显著富集。在结肠中，C-SP组隐窝深度和ZO-1表达明显减少。C-SP组促炎细胞因子、趋化因子和紧密连接蛋白mRNA表达水平显著升高。为进一步研究唾液细菌是否能在肠道中存活，用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)对唾液微生物群进行染色并移植到小鼠体内。结果发现，PH组和SP组的唾液微生物可以在肠道中持续存在至少24小时。因此，本研究数据表明，牙周炎可能通过唾液微生物的流入导致肠道微生物群失调。

论文ID

原名：Periodontitis may induce gut microbiota dysbiosis via salivary microbiota

译名：牙周炎可能通过唾液微生物群诱导肠道菌群失调

期刊：International Journal of Oral Science

IF：24.897

发表时间：2022.6.23

通讯作者：陈斌＆闫福华

通讯作者单位：南京大学医学院附属口腔医院

DOI号：10.1038/s41368-022-00183-3

实验设计

结果

1 临床特征

实验流程图如图1所示。纳入和排除标准见附录表1。共纳入37名参与者，即严重牙周炎患者(SP组，n = 21)和牙周健康个体(PH组，n = 16)。PH组平均年龄(31.06±8.13)小于SP组(44.62±10.42)。PH组与SP组的性别、体重指数、吸烟习惯相似，见附录表2(P > 0.05)。SP组的软垢指数(DI)、菌斑指数(PLI)、牙石指数(CI)和牙龈指数(GI)均显著高于PH组，见附录表3(P < 0.05)。

图1 实验流程图。

2 牙周炎患者的肠道菌群组成发生改变

为了证实牙周炎对肠道微生物群的影响，我们用16S rRNA分析了PH组(PH-F，n = 16)和SP组(SP-F, n = 21)粪便微生物群的差异。粪便微生物群的α多样性指数(Chao1和Shannon)表明PH和SP组之间没有显著差异(P > 0.05)(图2a，b)。此外，主坐标分析(PCoA)图和聚类树显示，两组之间的微生物组成存在显著差异(P < 0.05)(图2c,d)。根据线性判别分析(LDA)，SPF组中富集丹Erysipelotrichaceae、Lachnospiracea_incertae_sedis和Blautia，而PH-F组中富集Formosa和Mitsuokella (P < 0.05)(图2)。这些结果表明，牙周炎患者与牙周健康个体的肠道菌群组成存在差异。

图2 牙周炎患者肠道菌群的改变。a-b，α多样性-Chao1和Shannon指数。数据以平均值±SD显示。通过Wilcoxon检验确定统计学显著性。c-d，主坐标分析(PCoA)和聚类分析显示单独聚类(Adonis分析，P < 0.05)。e，SP组富集的分类群LDA 得分为正(红色)，而PH组富集的分类群LDA得分为负(绿色)。显示了LDA评分>2.0的分类群。PH组n = 16，SP组n = 21。*P < 0.05。

3 牙周炎唾液菌群增加的牙周致病菌可进入肠道

为了证实上述假设，即牙周炎引起的肠道微生物群变化可能是由于吞咽唾液，本研究采用16S rRNA测序比较PH组(PH-S, n = 16)和SP组(SP-S, n = 21)的唾液微生物群差异，然后进行Source Tracker分析以探索口腔和肠道微生物群之间的联系。与PH组相比，SP组唾液微生物群的Shannon指数显著升高(P < 0.05)，而粪便微生物群的Chao1指数在PH和SP组之间没有显著差异(P > 0.05)(图3a, b)。PCoA表明PH-S和SP-S样本分别聚类，如图3c所示。根据线性判别分析(LDA)，SP组富集了卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)、Tannerella、Treponema，PH组富集了链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)(P < 0.05)(图3d)。此外，我们采用Venn图和Source Tracker分析检测唾液和粪便样本中的常见微生物(图3e, f)。SP组唾液和粪便样本之间共有的操作分类单元(OTUs)数量大于PH组，这表明牙周炎患者的唾液和粪便微生物群更相似(图3e)。这些结果表明，牙周炎患者肠道中的口腔源性细菌可能多于牙周健康个体。Source Tracker分析显示，18.75%的牙周健康个体和52.38%的牙周炎患者的肠道微生物群中存在唾液源性细菌，SP组的检出率较高。牙周健康人群的唾液源性细菌占肠道微生物群的0.6%，而牙周炎患者的这一比例上升到5.88%，表明牙周炎患者的胃肠道中保留了更多的唾液源性细菌(图3f)。以上结果支持了我们的假设，即牙周炎唾液微生物可能通过进入胃肠道引起肠道微生物群失调。

图3 牙周炎唾液菌群增加的牙周致病菌可能进入肠道。a-b，唾液微生物群的α多样性指数(Chao1和Shannon指数)。使用Wilcoxo检验确定统计学显著性。数据以平均值±SD显示。c，基于未加权UniFrac距离的主坐标分析(Adonis分析，P < 0.05)。d，LDA图显示了PH-S(绿色条)和SP-S(红色条)组中显著富集的细菌。显示了LDA评分>3.25的分类群。e，维恩图显示了唾液和粪便中共有的细菌。f，Source Tracker分析显示粪便样本中的唾液源性微生物群。唾液(+)表示PH组和SP组肠道微生物群中含有唾液源性细菌的百分比。唾液(－)表示PH组和SP组肠道微生物群中不含唾液源性细菌的百分比。“唾液”是指粪便样本中唾液源性细菌的比例，“未知”是指非唾液源性细菌的比例。PH组n=16，SP组n=21。*P < 0.05。

4 SP患者牙周病原菌的移植改变了小鼠盲肠菌群并诱发了轻度肠道炎症

为进一步研究牙周炎相关唾液微生物对小鼠肠道微生物群和黏膜屏障的影响，将PH组和SP组的唾液微生物群通过口服管饲法移植到小鼠体内(C-PH组，n = 6；C-SP组，n = 6)，两周后分析盲肠微生物群和肠黏膜屏障(图4a)。C-SP组小鼠的肠道微生物群发生了显著变化。盲肠微生物群的Chao1和Shannon指数在两组之间无显著差异(P > 0.05)(图4b, c)。根据PCoA，两组盲肠微生物群存在显著差异(P < 0.05)(图4d, e)。根据LDA，阿克曼氏菌属(Akkermansia)在C-PH组富集，而卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)和梭杆菌属(Fusobacterium)在C-SP组富集(P < 0.05)(图4f)。

图4 牙周炎患者的唾液微生物群导致小鼠肠道菌群失调。a，C-PH(n = 6)和C-SP(n = 6)组的实验流程图。b，c，盲肠微生物群的α多样性指数(Chao1和Shannon指数)。数据以平均值±SD显示。使用Wilcoxon检验确定统计学显著性。d,e，基于未加权UniFrac距离的主坐标分析(Adonis分析，P < 0.05)。f，LDA图显示了C-PH和C-SP组的分类差异。显示LDA评分>2.0的分类群。

此外，在C-SP组中观察到小鼠肠黏膜屏障发生改变。与C-PH组相比，C-SP组肠黏膜屏障的隐窝深度显著降低(P < 0.05)(图5a，b)。免疫荧光染色显示C-SP组中ZO-1的表达水平显著降低(图5c, d)。与C-PH组相比，C-SP组紧密连接蛋白(连接粘附分子3(Jam3)、ZO-1、claudin-2(Cldn2)、claudin-3 (Cldn3)、claudin-15 (Cldn15)、occludin)的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)(图5e)。此外，与C-PH组相比，促炎因子和趋化因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 (IL-6)和集落刺激因子1(Csf1)的mRNA表达水平在C-SP组中显著上调(P < 0.05)(图5)。与C-PH组相比，C-SP组的抗炎细胞因子(如白细胞介素-10 (IL-10))显著降低(P < 0.05)(图5)。两组之间(c-x-c基序)配体1(Cxcl1)和纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1)的表达水平没有显著差异(P > 0.05)(图5)。上述结果表明，牙周炎通过唾液微生物群诱导肠道菌群失调和肠道轻度炎症。

牙周炎唾液微生物群可能留在盲肠中，因为确定唾液微生物是否可以在肠道中存活将有助于我们了解牙周炎唾液微生物群如何影响肠道微生物群，我们用活细菌特异性染料(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE))对唾液细菌进行染色，并在灌胃后追踪小鼠肠道中的荧光细菌(每组n=6)，如图6a所示。SP组的微生物悬浮液浓度(0.707×109 CFU/mL)显著高于PH组(0.158×109 CFU/mL)(图6b)。CFSE染色后，染色微生物悬液的平均荧光强度(Stain-PH-S组为2217.43±405.05；Stain-SP-S组为4195.47±236.66)显著高于未染色微生物悬液的平均荧光强度(Con-PH-S组为975.66±1.16，Con-SP-S组为752.67±31.19)(图6c)。

2小时后，Stain-SP-S组盲肠内容物的平均荧光强度显著高于Con-SP-S和Stain-PH-S组(P < 0.05)(图6d，e)，表明SP组2小时内进入盲肠的唾液源性细菌更多。24小时后，染色组盲肠微生物群的平均荧光强度显著高于未染色对照组(P < 0.05)(图6f，g)。这些数据表明，唾液细菌在胃肠道中驻留至少24小时。

图5 牙周炎患者的唾液微生物群影响小鼠的肠道屏障。a，HE染色结肠切片的代表性图像。b，HE染色结肠切片的结肠隐窝深度测量。比例尺，50 μm。c-d，针对ZO-1(红色)和DAPI(蓝色)的近端结肠组织免疫荧光染色切片的代表性图像和测量值。比例尺，20 μm。e-f，近端结肠组织中促炎因子、趋化因子和紧密连接蛋白mRNA表达的倍数变化。数据以平均值±SD显示(每组n=4-6)。使用t检验确定统计学显著性。*P < 0.05。

图6 牙周炎唾液微生物群可在肠道中持续存在至少24小时。a，说明如何处理唾液微生物群并移植到小鼠体内的实验流程图(每组n = 6)。b，PH组和SP组微生物悬浮液的浓度用OD600测定。数据以平均值±SD显示。使用t检验确定统计学显著性。c，PH组和SP组未染色和染色的微生物悬浮液的平均荧光强度。数据以平均值±SD显示，并与未染色的PH唾液微生物群数据进行比较。采用单因素方差分析确定统计学显著性。d-g，灌胃后2、24小时，胃肠道(小肠、盲肠、结肠)荧光阳性菌的分布情况。将数据与Con-PH-S组进行比较并表示为平均值或平均值±SD。采用单因素方差分析确定统计学显著性。*P < 0.05。

讨论

牙周炎发病率高，危害全身。在本临床研究中，我们发现牙周炎可能通过唾液微生物的易位引起肠道微生物群失调和肠道炎症。本研究的结果进一步支持了健康牙周状况的重要性。此外，唾液微生物易位到肠道的机制是优化理解牙周炎如何影响肠道微生物群的基础。深入地说，牙周炎的治疗可能为治疗难治性肠道微生物相关的系统性疾病提供了一种新的潜在方法。

本研究表明，牙周炎会导致肠道菌群发生变化。在很大程度上，这一发现与临床研究一致。值得注意的是，β-多样性揭示了本研究中PH组和SP组之间粪便微生物组成的显著差异(图2c)。然而，在本研究中，慢性牙周炎(n = 23)、牙龈炎(n = 14)和牙周健康(n = 7)的个体之间没有显著差异。我们推测这种差异可能是由于牙周炎患者的纳入标准不同所致。前一项研究包括中度和重度牙周炎，导致组内差异较大，样本量小，难以得出结论。在本研究中，我们只纳入了严重牙周炎患者，这可以将组内差异最小化，从而提供更显著的全身效应。因此，未来需要多中心、大样本的临床研究来进一步明确这些具体差异。上述证据也表明，牙周炎的严重程度可能与牙周炎引起的肠道微生物群变化密切相关。因此，未来有必要设计相关实验来验证这一假设。

如前所述，当前研究结果表明，PH组和SP组之间的肠道微生物群存在差异。当然，研究牙周炎影响肠道菌群的机制是揭示两组肠道微生物群差异的基本策略。考虑到成年人每天吞咽约1012个细菌，唾液源性微生物可能在肠道定植，牙周炎患者肠道微生物群变化的重要机制可能与牙周细菌通过唾液进入肠道有关。因此，我们比较了PH组和SP组的唾液微生物群。SP-S组富集了显著更高数量的厌氧菌，如卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)、Tannerella和Treponema(图3d)，这与龈下牙菌斑中牙周病微生物群的典型特征一致。这些发现与之前的研究结果一致。Source Tracker分析显示，SP组改变的粪便样本中存在更多的口腔源性细菌(图3f)，Iima等人也发现口腔和肠道微生物群的相似性，这支持了我们的假设，即牙周炎患者的唾液微生物群可能通过进入胃肠道导致肠道菌群失调。

为了验证上述假设，将PH组和SP组的唾液微生物群通过管饲法移植到小鼠体内。与人类研究的结果相似，小鼠的肠道微生物群也存在显著差异(图4d, e)。牙卟啉单胞菌科和梭杆菌属是牙周炎和肠道炎症的共同病原体，在C-SP组的肠道中显著富集(图4f)。有趣的是，人类唾液样本中也富含卟啉单胞菌科，揭示了唾液和肠道微生物群之间的密切关系。此外，梭杆菌具有粘附和聚集功能，可与大多数口腔细菌结合。梭杆菌还可以粘附在一些肠道病原菌上，可能会扰乱肠道菌群，导致肠道炎症，并有可能成为检测早期肠道疾病的生物标志物之一。这些结果表明，唾液来源的牙周病微生物群可能进入肠道。

为了研究唾液微生物群对肠道的影响，我们评估了肠道炎症水平和通透性的变化。C-SP组细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平升高(图5f)，表明肠道处于轻度炎症状态；此外，肠黏膜屏障受损，IF染色显示ZO-1表达水平降低，C-SP组隐窝深度降低(图5a-d)，这与其他研究一致。然而，作为检测肠黏膜屏障通透性的重要标志物，紧密连接蛋白的mRNA表达水平在C-SP组中升高(图5e)。这似乎是矛盾的，但实际上可能是对轻度肠道炎症的一种代偿性反应。当肠道屏障受到外界刺激时，肠道上皮的紧密连接结构会被破坏，紧密连接蛋白的表达减少。此外，肠上皮细胞上调这些紧密连接蛋白的基因表达水平，以补偿紧密连接的破坏。因此，一个矛盾的情况出现了：紧密连接蛋白的蛋白水平可能会下降，而基因表达水平可能会增加，这在以前的研究中报道过。这可能是肠上皮细胞破坏的一个阶段。当上皮细胞功能进一步受损并超过代偿能力时，紧密连接蛋白水平和基因表达水平都会降低。

上述结果进一步验证了牙周炎唾液微生物群可通过移植影响肠道微生物群稳态。然而，唾液微生物群影响肠道菌群的潜在机制尚不清楚。因此，探索唾液细菌是否能在肠道中持续存在是至关重要的。用CFSE染色唾液微生物群以追踪肠道中的细菌分布。CFSE是一种活细菌特异性染料，可以很容易地穿过膜并在活细菌体内转化为荧光物质，而在死细菌体内则不行。该荧光产物很稳定，可以保留在活细菌中以追踪唾液细菌。我们发现在小鼠肠道中至少可以检测到24小时的唾液细菌(图6和附录图1)，这表明牙周细菌可以通过唾液进入肠道并可能存活。

牙周炎影响肠道的主要机制可能有两种：宿主免疫反应或口腔细菌异位定植。以往的研究主要集中在牙周袋和血液循环之间的联系。龈下微生物可能通过溃疡性牙周袋侵入循环，导致轻度全身炎症，从而导致肠道免疫失衡和肠道微生物的改变。相比之下，一些研究人员认为，假定的牙周病原体可能会随着唾液进入肠道，进一步扰乱肠道微生物群的稳态。

唾液-肠道途径可能是牙周炎影响肠道微生物群的另一个途径。然而，尚不清楚唾液-肠道途径是否是与牙周袋-血液循环途径无关的独立机制。虽然已经报道了通过口服接种牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)来检验这一理论的初步试验，但使用口服接种(特别是使用2%羧甲基处理的细胞来促进细菌定植)可能无法排除牙周袋-血液循环途径涉及的可能机制。此外，很难用单一细菌物种来模拟这些患者的实际状态。相反，我们试图通过从牙周炎患者中分离唾液微生物群来模拟临床情况，通过管饲法将微生物悬浮液移植到牙周健康的小鼠体内，而不是使用结扎模型。因此，我们可能有效地避免了局部牙周炎症刺激的全身免疫炎症反应对肠道的影响；此外，唾液微生物的组合比单一菌株更接近临床条件。因此，我们能够成功地观察到吞咽的口腔菌群可以独立地引起肠道菌群失衡，并扰乱肠道黏膜屏障。我们已经证明了唾液-肠道途径对牙周炎对肠道微生物群影响的独立性。

由于很难从患有牙周炎的小鼠身上采集唾液样本，因此在实验中替代地使用了人类唾液。这种方法具有局限性：人类的口腔微生物群和肠道微生物群与小鼠不同。因此，人体口腔微生物群相关、无菌和粪便微生物群移植模型可被考虑在未来的研究中探索口腔和肠道微生物群之间的关系。

综上，本研究表明，牙周炎可能通过唾液微生物的流入引起肠道微生物群失调，而唾液中的微生物进入肠道并定植可能是导致这一现象的重要原因。进一步的研究应该关注涉及哪些细菌以及它们如何影响这一过程。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41368-022-00183-3