香脂提取物对草酸钙晶体物相和形态的影响

香脂提取物对草酸钙晶体物相和形态的影响

Montealegre CM, De Leon RL. Effect of Blumea balsamifera extract on the phase and morphology of calcium oxalate crystals. Asian J Urol. 2017 Oct;4(4):201-207. doi: 10.1016/j.ajur.2016.08.009. Epub 2016 Sep 3. PMID: 29387552; PMCID: PMC5772838.

方法

通过光学显微镜、图像分析、粉末X射线衍射和扫描电子显微镜研究了香脂提取物对草酸钙晶体形态的影响。

结果

根据过饱和程度，提取物将晶体尺寸降低了 5.22%–82.62%。通过分析晶体的投影面积，发现提取物将晶体的相从 COM 转变为二水草酸钙 (COD)。这种相移是显着的，在 0.5 mg/mL 提取物时 COM 到 COD 的偏移为 88.26%，在 1.0 mg/mL 提取物时为 91.53%。扫描电镜 (SEM) 图像显示在 0 mg/mL 提取物中晶体聚集。在提取物浓度为 1.0 mg/mL 时，扫描电子显微照片显示出可辨别的晶体单元边界。

结论

观察到B. balsamifera提取物具有减小的晶体尺寸，将晶相从 COM 转变为 COD 并防止草酸钙晶体的聚集。

  关键词：肾结石，草酸钙结石，香脂提取物，显微镜检查，二水草酸钙

一、简介

肾结石一直是人类面临的普遍健康问题。肾结石由抗体和蛋白质等生物分子、一水草酸钙 (COM, CaC 2 O 4 · H 2 O)、二水草酸钙 (COD, CaC 2 O 4 · 2H 2 O)、磷酸钙鸟粪石 (MgNH 4 PO 4 · 6H 2 O) 和尿酸 , 等矿物质组成,  。一些肾结石是由胱氨酸制成的，但病理上最常见的是 COM 结石。对肾结石病例的分析在 99% 的提取结石中发现了 COM ，在 68% 的病例中，COM 被确定为主要结石成分 。已经发现草酸钙的水合物根据它们的水合程度表现出不同的晶体结构。一水合物相 (COM) 具有细长的菱面体单元的晶体结构。 具有明显的六边形投影。各种研究表明，二水合物相 (COD) 具有八面体或方形双锥结构，具有明显的方形投影 。 COM 晶体的生长受到生长调节剂的影响，生长调节剂具有广泛的性质，从无机化合物到生物生产和合成的有机化合物。一些研究探讨了草药治疗尿路结石的生长调节特性。发现 Khella 植物的提取物会影响结晶过程。在存在提取物的情况下，相对于对照，形成的 COD 多于 COM 晶体 [5] 。一种马略卡草药制剂，含有玉米、熊果、Sabal serrulata等的提取物和酊剂，可减少乙二醇灌胃大鼠肾组织中的钙沉积 [10] . 基于多糖的生物聚合物（如阿拉伯树胶）也被证明可以稳定具有四方双锥或八面体形态的 COD 的形成 。         

发现Bergenia ciliata根茎提取物可降低人工尿液结晶溶液的吸光度。基于对照溶液的吸光度降低，据报道，58%–97% 的剂量依赖性抑制 。还发现 COM 和 COD 晶体减少，但这仅基于晶体显微照片的定性评估，缺乏量化。这些影响归因于提取物中的多酚类物质，例如皂苷、生物碱、黄酮类和萜类化合物。涉及植物提取物晶体生长抑制的研究有限，但治疗已经存在了数千年，甚至在古埃及文献中也提到过 。 据报道， Blumea balsamifera ( B. balsamifera )叶子的煎剂具有抗结石作用，是治疗肾结石的一种方法。这种治疗效果归因于B. balsamifera  [14] 的利尿作用，但基于 Rodgers 等人的研究。 [15] 不能断定治疗效果仅仅基于这种特性。更重要的是，B. balsamifera含有几种可能对 COM 结石形成有抑制作用的化合物。 B. balsamifera 如何影响草酸钙的结晶过程尚未得到充分探索。本研究旨在通过研究 香脂 提取物对由过饱和钙离子和草酸盐离子溶液形成的草酸钙晶体的相和形态的影响来填补部分知识空白。

2。材料和方法

通过光学显微镜、图像分析、粉末X射线衍射和扫描电子显微镜研究了香脂提取物对草酸钙晶体形态的影响。整个实验中使用的所有溶液均用去离子水制备。

2.1 提取物制备

B. balsamifera的提取物是从市售的 Golden Spoon™（Seamaxx Enterprises，Manila，Philippines）有机植物全天然三宝茶的煎剂中制备的。Golden Spoon™ 声称由纯手工挑选的B. balsamifera制成树叶。叶子在去离子水中煮沸5分钟。用纤维素滤纸过滤液体部分并转移到容量瓶中。使用沸腾的去离子水反复洗涤直至获得澄清液体。在最后调整体积之前将煎剂冷却。在施用之前制备浓度为每毫升溶液 5 毫克干叶的新鲜煎剂。从新鲜制备的汤剂中制备不同浓度的提取物。将所需量的提取物与结晶溶液混合并用去离子水稀释至最终体积。

2.2. 光学显微镜

    通过在一次性聚丙烯比色皿中反应性 沉淀氯化钙和草酸钠溶液来生长晶体 。这些在室温下储存 72 小时以达到平衡。然后搅拌比色杯的内容物，收集样品并安装在血细胞计数器中并在光学显微镜下观察。拍摄显微照片并通过 ImageJ v1.47t (  https://imagej.nih.gov/ij/download.html  ) 对图像进行图像分析以测量晶体尺寸。通过使用最大 Feret 直径和最小 Feret 直径之间的比率来量化形状。

2.3. 粉末 X 射线衍射和扫描电子显微镜

    通过本体结晶制备晶体。然后混合所需量的水、提取物、草酸钠溶液和氯化钙溶液。用薄膜覆盖溶液并静置3天。通过在 2504 ×  g下离心30 分钟来收获晶体。弃去上清液，将晶体在干燥器中干燥3天。在分析之前将干燥的晶体密封并保持在干燥器中。     使用 Rigaku Miniflex II 和 Hitachi S3400N 扫描电子显微镜 (SEM) 通过 粉末 X 射线衍射分析样品（分析在菲律宾奎松市迪利曼大学化学工程系进行）。 相应地调整放大倍率和电子束电压。

2.4. 实验设计

在不同的过饱和度和提取物水平下研究了提取物对晶体形态和成核的影响。过饱和度从 10.0、12.5、15.0、17.5 到 20.0 不等。这些过饱和度基于 COM 在 25°C 下的溶解度，计算公式为： 钙和草酸盐的浓度保持在 1:1 的比例，因为研究表明它们的比例变化也会影响所产生晶体的形态。将采用溶度积常数的文献数据，即K sp,25°C  = 10 -8.69  。因此，在过饱和度为 10 时，氯化钙和草酸钠的摩尔浓度相当于 0.4519 mmol/L 的值。 提取物添加量限制为 3： 空白 0 mg/mL、0 .5 mg/mL 和 1.0 mg/mL。 这种浓度的表示方式是指用于制备汤剂的干燥叶子的质量与将提取物加入结晶溶液后形成的溶液的最终体积的比值。

3。结果与讨论

当结晶溶液中不存在提取物时，COM 主要（如果不是单独）在所有过饱和度上形成，如图所示 图。1 . COM 晶体很容易通过其特有的六边形形状来识别。在没有提取物的溶液中，晶体的数量也有限，但尺寸更大。在较高的过饱和度下也观察到异质生长。 图 2 , 图 3 表明在溶液中存在提取物的情况下，72 h 后形成的晶体尺寸明显小于没有提取物时形成的晶体尺寸，而显微照片中的晶体数量随着尺寸的减小而增加。八面体 COD 晶体的方形投影在这些显微照片中占主导地位。

图1  用 0 mg/m L 提取物在 10.0 (A)、15.0 (B) 和 20.0 (C) 的过饱和度下的显微照片。 在所有过饱和度下都观察到少量一水草酸钙晶体（A 和 C 为 × 640，而 B 为 × 160）。

图 2  用 0.5 mg/mL 的提取物在 20.0 的过饱和度下的显微照片显示以二水草酸钙晶体为主的晶体形成 (×640)。

图 3  用 1.0 mg/mL 的提取物在 20.0 的过饱和度下的显微照片显示以二水草酸钙晶体为主的晶体形成增加 (×640)。 然后使用软件 ImageJ 对显微照片进行图像分析。在显微照片上进行诸如调整亮度、对比度和转换为所需格式等处理，直到它们适合图像分析，并且可以根据它们的大小和形状来表征颗粒。

3.1 晶体尺寸

    颗粒的大小被报告为费雷特直径 ( d F ) 和等效圆直径 ( d eq )。确定基于d F和d eq的晶体粒度分布 (PSD) 。 图 4 , 图 5 显示含有 0 mg/mL 提取物的过饱和水平 20 的粒度分布。正如定义的那样，当测量的粒子是圆形时， d F本质上大于d eq或等于。COM 和 COD 的晶体具有比等效圆直径更长的对角线。与d eq相比，d F的 PSD覆盖的范围也更广。

图 4  没有提取物的过饱和 20 的 Feret 直径粒度分布。众数和中位数出现在 0.0075 mm（双样本配对 t 检验， p   < 0.075）。

图 5  没有提取物的过饱和 20 的等效圆直径粒度分布。众数和中位数出现在 0.0075 mm 处，类似于 Feret 直径粒度分布（双样本配对 t 检验， p   < 0.075）。 将粒径表示为d F或d eq作为算术或面积平均值将导致表示粒径的四种可能方式。d F和d eq的算术平均值和面积平均值总结在 图 6 .

图 6 含有 0 mg/mL 提取物的不同过饱和度的平均直径。不管用什么方法表示直径，它通常随着过饱和度的增加而减小，过饱和度在 12.5 和 15.0 之间不连续。 由于大小颗粒对平均直径的贡献相等，因此面积平均直径始终大于算术平均值。 图 6 还表明，面积平均值d F报告的直径最高，其次是算术平均值d F，面积平均值d eq和算术平均值d eq最小. 过饱和度的相对标准偏差为 23.24%–26.93%，但过饱和度 20 的相对标准偏差高达 46.54%。无论采用何种表示平均值、直径及其组合的方法，直径相对于饱和度的变化趋势都是相似的。增加过饱和度会减小晶体的直径。从 10-12.5 和 15-20 的过饱和度来看，这是正确的，但在 12.5 和 15 之间观察到跳跃不连续性。 添加香脂提取物后，晶体的大小在所有过饱和度和提取物浓度下基本恒定，面积平均值d F为 (9.63 ± 0.76) μm，对应于 7.84% 的相对标准偏差。 相对于未处理的系统，平均直径从 5.22% 到 82.69%（取决于平均和直径的类型）发生了显着变化，如图所示 图 7 . 晶体尺寸的减小在过饱和度为 15.0 时最高，平均而言，在过饱和度为 12.5 时最小。

图 7  在所有过饱和水平下，0.5 和 1.0 mg/mL 提取物的晶体尺寸急剧下降。

3.2. 水晶形状

晶体的形状表明其类型。 图 8 显示了从晶体的显微照片中观察到的典型投影。COM 晶体由细长的菱面体单元组成，沿其 (010) 和  ( 101¯)显示的面孔 图 8 分别为 A 和 B。COD 晶体为八面体，具有方形或菱形投影，如图所示 图 8 C. 这些不同的晶体形态被用作区分草酸钙水合物的主要手段。 图 8 D显示草酸钙三水合物晶体的短哑铃形突起。这种形态在本研究中仅观察到一次。

图 8  草酸钙晶体的显微照片。 (A) 一水草酸钙晶体的 (010) 面。 (乙)  101¯一水草酸钙晶体的表面。(C) 八面体草酸钙二水合物晶体的顶视图。(D) 草酸钙三水合物晶体的哑铃形横截面特征。

 纵横比用于区分 COM 和 COD 晶体。长宽比大于 1.5 的晶体被归类为 COM。为了确定形成的 COM 和 COD 晶体的相对丰度，将确定为 COM 的晶体的投影面积相加，并计算其在总投影面积中的比例。 图 9 总结了不同程度的过饱和度和提取物水平的 COM 分数。

图 9  一水草酸钙占预计的是 0 mg/mL 提取物的部分。 

提取物的存在导致草酸钙一水合物部分的减少，表明草酸钙二水合物晶体的主要形成。 图 9 表明 COM 晶体主要以 0 mg/mL 的提取物存在。0.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL 提取物的存在使晶体的形态显着转变为 COD 的形成。COM 晶体的面积分数从没有提取物的平均 0.9932 ± 0.0122 变为分别在 0.5 和 1.0 mg/mL 提取物时的 0.1158 ± 0.1287 和 0.0842 ± 0.0928。这对应于 0.5 mg/mL 时的平均 COM 面积分数减少 (88.26 ± 13.03) 和 1.0 mg/mL 时 (91.53 ± 9.29)。减少百分比的高标准偏差意味着在 0.5 或 1.0 mg/mL 的提取物水平之间没有显着差异。各种关于生长调节剂的研究报告了类似的 COM 到 COD 转变 [5] 、 [7] 、 [16] 但只有在这项研究中，这种转变才被量化。 一些难以通过上述方法量化的显微镜观察结果未包括在分析中。这种观察的一个例子显示在 图 10 . 这是在 17.5 的过饱和度下观察到的。

图 10  由具有高度分支和晶体间生长的聚集晶体形成的结构。 这可以通过超出本研究范围的高度异质成核来解释。十字形结构可能是过度生长的结果  011¯和 COM 的 011 个面。这些仅在没有提取物的情况下在 17.5 和 20 的过饱和水平下观察到。在这些条件下，晶体习性可能会改变。事实上，高度聚合的结构就像图中所示的那样 图 10 仅当结晶溶液中不存在提取物时才观察到，这表明提取物对聚集和观察到的过度生长具有抑制作用。

3.3. 粉末 X 射线衍射和扫描电子显微镜

将过饱和度为 20 的晶体风干。粉末 X 射线衍射光谱显示出强峰，表明样品的结晶性质。 图 11 表明在 0.1 mg/mL 的提取物中，COM  [17] 的特征峰具有最高强度。然而，在 1.0 mg/mL 的提取物中，COM 峰的强度相对于 2 θ位置 44.5°、64.8° 和 77.86°处的强峰非常低，表明四方晶体的 (200) 和 (211) 面 [ 18] 。光谱强度支持以下观察：在低提取物浓度下，主要形成 COM 晶体，在 1.0 mg/mL 的最高提取物浓度下，观察到 COM 的峰，但与与 ( 200) 可能指示 COD 的四方晶体的面。与显微照片的比较 图 3 表明这些强峰可能归因于 COD。

图 11 样品的粉末 X 射线衍射光谱在 20.0 的过饱和度和 0.1 mg/mL (A) 的提取物水平和 1.0 mg/mL (B) 的提取物水平下显示出强峰。交叉标记是指草酸钙一水合物的特征峰 [17] 。 使用 SEM 拍摄显微照片，如图所示 图 12 .

图 12  扫描电子显微镜显微照片。 (A) 对于没有提取物的过饱和度 20.0，显示出难以辨认的晶界。 (B) 在过饱和度 20.0 和 0.1 毫克/毫升的提取物可识别晶界观察到。 (C) 在 1.0 mg/mL 提取物的过饱和度 20.0 下观察到不同的晶界。      图 12 C 显示了在最高过饱和度 20 下晶体形态如何变化。在 图 12 A 没有提取物，很难辨别晶体之间的边界，这表明异质生长导致不同晶体单元的合并。在 图 12 B，少量添加 0.1 mg/mL 的提取物会产生可辨别的单个晶体单元。观察到聚集，但比前者少得多。水晶在 图 12 C 在 1.0 mg/mL 的提取物浓度下生长。晶体单元是独立的，较小的，形状是可辨别的。COM的（010）和（101）侧的晶体形状特征很明显。大部分形成的晶体也具有从其方形投影明显的低纵横比。这些观察结果显然支持了之前提出的主张，即，香脂提取物除了改变形态外，还最大限度地减少了晶体聚集。 结果表明，B. balsamifera提取物减小了晶体尺寸，将晶体相转变为 COD，抑制了晶体聚集。这可能是由于添加化合物（在这种情况下是香脂提取物中的植物化学物质）引起的结晶介质溶液性质的改变。即使在非常低的浓度下也观察到了这种影响 [7] 。据报道，由于 Khella 植物提取物导致表面自由能降低，因此植物提取物引起的溶液性质发生了类似的变化 。

4 结论

     在不同的过饱和度和提取物浓度下拍摄的显微照片在晶体大小和形状方面表现出显着差异。根据平均 Feret 和等效圆直径分析晶体尺寸表明，在 0.5 和 1.0 mg/mL 的提取物下，尺寸下降了 5.22%–82.69%，具体取决于饱和程度。晶体根据纵横比分为 COM 或 COD。发现在 0.5 mg/mL 的提取物和 0.0842 ± 0.0928 1.0 mg/mL 的提取物下，COM 晶体的投影面积分数从平均 0.9932 ± 0.0122 降低到 0.1158 ± 0.1287，这表明 COM 晶体相从 COM 转移到 COD。 该提取物减小了晶体尺寸，将晶体相转变为COD并抑制了晶体聚集。这可能有利于预防结石形成。不仅形成的晶体会更小，而且这些晶体可能具有较低聚集可能性的暗示表明形成的晶体可以更容易地通过自然方式消除。这对结石形成者非常有益，因为研究表明结石形成者的生化途径总是会促进结石形成，但生长调节剂（如在 B. balsamifera 中发现的植物化学物质）的存在可能有助于消除结石。