NSCLC基因间区断点融合检测和验证

2022-06-30 17:35

FISH作为检测ALK和ROS1重排的标准方法，但该方法不能推断融合伴侣、断点位置或转录物。

一、背景

激酶融合通常是靶向治疗药物开发和使用的潜在靶点。NSCLC典型的激酶融合包括ALK、ROS1、RET、NTRKs、NRG1、FGFRs、EGFR和MET。融合检测方法包括FISH、IHC和2种NGS检测方法（基于DNA检测内含子和外显子融合，基于RNA方法仅检测剪接外显子融合）。基于DNA的NGS方法能够检测已知和未知的融合伴侣以及准确的断点。至少有一个基因组断点位于基因间区的融合是基因间区断点融合。由于没有嵌合形成完整的编码转录本不能产生嵌合蛋白质，所以理论上基因间区断点融合不具有功能性。最近有研究表明基于 DNA测序识别的基因组断点在转录水平上是不可靠的。因此，仍然难以阐述这些基因间区断点融合是否具有功能性。这使得肿瘤专家对治疗选择产生疑虑。

二、基于DNA测序识别基因间区断点融合

总共2575例NSCLC患者，其中转移或者手术切除的有2202例（cohort 1），未经过手术的I到IIIA期肺腺癌且EGFR/KRAS/BRAF突变阴性的有373例（cohort 2）。cohort 1中有267例（12.1%）检出激酶融合，cohort 2中有97例（26.0%）；其中26例（7.1%）包含基因间区断点融合。

表一、基因间区融合样本统计

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三、基因间区断点融合验证基因间区断点融合验证

表二、比较不同方法检出26例样本的融合结果 86261656580288238

Case 1通过DNA NGS方法检出intergenic-3’ROS1融合，在FISH中检出阳性，但是基于RNA的NGS和IHC中检测为阴性，表明该融合未能产生充分的转录物/蛋白质。类似的， cases 2到4（FGFR1-intergenic）以及case 5（MET-intergenic）基于RNA的NGS也未检出。

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图一、2种代表性的基因间区融合的基因组特征

在case6中，DNA NGS检出ALK与YY1P2下游的基因间区发生融合，FISH和IHC检出阳性，通过RNA测序检出经典的EML4-ALK融合（E13:A20）。类似的复杂融合现象也在cases 7–10中发现。

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图二、识别ALK融合

Case 11和12在DNA层面发现intergenic-3ʹROS1融合，断点位于TPM3基因的下游。通过IHC检出了ROS1融合阳性，基于RNA检出TPM3-ROS1融合。选择性剪接可能跳过TPM3的终止密码子形成框内融合转录物。

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图三、识别ROS1融合

Case 13通过DNA检出5ʹRET-intergenic融合，在FISH中发现融合阳性，通过RNA测序识别出KIF5B-RET融合转录物（K15:R12）。这可能是由于相互重排导致NDA测序仅检测到RET的RET反方向下游断点，并未检测出构成KIF5B和RET的primary junction。类似的包含14到16号样本。剩下的10个样本（cases 17–26）均未通过RNA测序检出（样本缺失或质量差），但是通过IHC检出3例ALK阳性，表明产生了功能性的ALK蛋白质。

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图四、识别RET融合

四、靶向治疗和临床疗效靶向治疗和临床疗效

Case 1，在测序之前通过FISH检测阳性，使用克唑替尼治疗疗效差，在治疗后4周疾病进展。随后通过DNA、RNA测序以及IHC检测，发现intergenic-3’ROS1融合，但是并未产生异常转录物/蛋白质。cases 6和18通过DNA测序检出intergenic-3’ALK融合，通过克唑替尼治疗使用RNA测序和IHC验证为融合阳性，case 6治疗16个月case 18治疗6个月，仍然未达到无进展生存期的终点。对于case21，DNA测序检出intergenic-30ALK，未进行进一步验证，克唑替尼治疗4周后部分缓解，病人持续克唑替尼治疗10个月后，病人病情仍然稳定。

表三、克唑替尼治疗病人的临床疗效 92101656580290342

五、总结

FISH作为检测ALK和ROS1重排的标准方法，但该方法不能推断融合伴侣、断点位置或转录物。因此，存在假阳性结果的可能性。由于IHC与利用了蛋白质，与治疗更相关。然而，大多数IHC检测的是蛋白表达水平，而不是融合抗原部位，只是对融合事件的间接评估。由于基于RNA的NGS融合检测识别了可以直接转换为蛋白质的融合转录物，凸显出其临床价值。然而，本研究中38.5%的病例(10/26)由于样本缺失或质量较差，未能使用基于RNA NGS进行检测，这既反映了更严格的样本质量要求的限制，也反映了目前临床实践将基于DNA NGS检测先于基于RNA NGS的检测来作为一线检测方法。此外，基于DNA NGS可以识别与RNA融合无关的重排，如ALK截短重排。本研究的局限性包括接受靶向治疗的基因间区断点融合病例数量相对较少。为了及时和广泛地检测临床样本以指导治疗，能够同时对DNA和RNA进行测序的NGS分析在临床实践中具有巨大的潜力。