荧光定量PCR仪的边缘效应

作者：同济大学附属东方医院胶州医院---王晓燕、高亚林、李玉杰

荧光定量PCR仪主要由PCR和荧光检测系统组成。目前，商品化的荧光定量PCR仪种类繁多。国外的品牌主要有ABI、Roche、MJ、Bio- Rad、Stratagene、Corbtt、Cepheid、SmartCycler等，国内有宏石、鲲鹏、安普利等。对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等，更重要的还在于样品孔之间的温度均一性，以避免微小的差别被指数级放大[1]。

边缘效应产生的原因

荧光定量 PCR 实验影响因素众多， 实验的成功与否，与备检样本核酸的提取、所用试剂的质量等因素有直接的关系， 而作为 PCR 技术必不可少的扩增仪，其性能的好坏直接影响到扩增效率[2]。

PCR仪的性能主要包括温度控制系统和荧光检测系统，荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。检测系统有超低温CCD成像系统和光电倍增管（PMT），如图：

温度控制系统

荧光检测系统

首先，边缘效应产生的主要原因是光路设计缺陷。对于边缘效应来说，采用 CCD检测器的定量PCR仪或多或少都会存在该问题。该问题主要来源于仪器的光路设计缺陷和控温模块性能的不稳定。传统的PCR仪光路设计采用的是 CCD的检测器，它把卤钨灯光源的光通过反射镜照射到96孔样品槽上，由于边缘孔和中间孔的光程不一样，所以光的能量在96 孔的分布不均，孔间的荧光基团获得的激发光能量有差异，导致96孔间荧光基团发射荧光的强度不一致，影响最终的实验结果。另外，CCD的信号采集模式属于 96 孔同时采集，很容易造成孔间信号干扰，如图所示：

传统定量 PCR 仪光路设计

96 孔板的孔间光强不一致

为了避免该问题，后续研发的定量PCR仪都采用新的仪器设计概念。目前应用的较成功的是逐孔独立扫描的设计。如Agilent Stratagene的 MX 系列定量PCR仪，其光路设计原理采用石英卤钨灯光源，光通过不同的滤光镜过滤获得特异波长的激发光，由300根小光纤组成的光纤束传递到单个样品孔，激发荧光基团。每个孔都是独立激发，所以光的强度是一致的。另外，荧光基团的发射光也是逐孔扫描检测 ，并通过光纤传递到检测器，这种设计有效地避免了边缘效应和孔间干扰。如图所示：

Agilent Stratagene 的 MX系列

其次，除了光路原因，加热模块的孔间温度均一性不足，也是造成边缘效应的重要原因。按照仪器的加热性能，可以将荧光定量PCR仪为3类[3]：

①一类是金属板式半导体（半导体+电热丝）加热。硅加热是使用最普遍的一种，具有导热好、易自动化、速度快、直接加热降温、效果好的特点，但由于其使用的介质是金属， 与反应管很难做到无缝接触。ABI、MJ、Bio-rad等多数仪器都属于这一类。

②另一类是离心式空气加热。用空气做介质可与反应体系无缝接触，但是空气具有导热性差、比热小的缺点。Roche的Roche LightCycler荧光定量PC仪、Corbett的Rotor-Gene荧光定量PCR仪均属此类。

③第三类是各孔独立温控式加热。不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，有效避免边缘效应，还可实现任意梯度反应。代表为SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪。

金属板式实时定量PCR仪

离心空气加热式实时定量PCR仪

各孔独立温控式加热式实时定量PCR仪

孔间均一性差异

孔间均一性主要是指96孔样品槽中任意两孔间温度差异大小。完美的温度一致性是很难达到的。以下是第三方机构对不同品牌的定量PCR仪控温模块做的比较测定。

不同品牌PCR仪加热模块温度均一性比较

在选购定量PCR仪之前，我们需要先了解仪器的设计原理，尽量选择没有边缘效应的PCR仪。随着科学技术的加速发展，不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，选购定量PCR仪时还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等[4]。目前，有厂家采用tas技术（TAS-MRAM技术是一项边用加热器对MTJ元件存储层进行加热，边写入数据的技术。对存储层进行加热后，矫顽力会下降，从而可轻松写入数据。介质在存储层中冷却后，矫顽力会再次提高，数据稳定性也会随之提高。TAS技术基本上是一项与硬盘（HDD）热辅助存储相同的技术），有效避免block热传导的边缘效应，温控更精准均匀。

专 家 点 评 

李玉杰，主任技师，同济大学附属东方医院胶州医院检验科主任

为什么采用荧光定量PCR检测时不宜将质控品位置固定？

室内质控是检验人员对实验室工作和测定结果进行的连续评价，以决定工作和结果的可靠性，其目的是保证每日或每批间测定的精密度。由于PCR扩增仪的反应板是由多孔组成，根据温度控制原理不同又可分为气体加热控温、压缩机控温和半导体加热控控温型，对于半导体和压缩机加热控温（金属板式）的PCR仪，由于边缘效应和各孔温度的不均一性等因素，各加热区域以及各加热孔之间温度可能存在一定的差异[5]，如果每次扩增时质控品的放置位置固定在某一孔，便不能全面反映由于样本位置不同对扩增效率带来的影响。因此，质控品在反应板中的位置不宜固定。

参考文献

[1] 杜琼，倪滔，刘小琦，等. ABI7700、7500 荧光定量 PCR 仪性能评价[J]. 实用医院临床杂志，2009，6（1）：63-64.

[2]李金明. 聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性[J]. 中华检验医学杂志，2005，28（3）：225.

[3] 田云. 荧光定量 PCR 仪的选购[J]. 医疗卫生装备，2006，27（5）：43- 44.

[4] 郑卫东，袁仕伟. 荧光定量 PCR 仪的边缘效应与实验误差分析[J]. 质控与安全，2013，34（2）：113- 115.

[5]《临床检验  一万个为什么》分子生物学检验分册

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