细胞自噬在七氟醚致老年小鼠海马区神经元细胞凋亡中的保护作用

王硕 熊万霞

复旦大学附属中山医院麻醉科，上海 200032

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(05):459-464.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210522‑00538

 基金项目 

国家自然科学基金青年科学基金项目（81801376）

ORIGINAL  ARTICLES

【论著】

本研究探讨细胞自噬在七氟醚致老年小鼠海马区神经元细胞凋亡中的作用机制。 

1 材料与方法      

8月龄BL/C57小鼠16只，按随机数字表法分为两组（每组8只）：七氟醚组和对照组。七氟醚组吸入47.5%空气+2.5%七氟醚+50%氧气3 h，对照组吸入50%空气+50%氧气3 h。建模后24 h进行新物体识别实验，随后断头取海马组织，尼氏染色检测海马神经元细胞凋亡情况，Western blot法检测海马神经元细胞自噬相关蛋白［微管关联蛋白（LC）3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline‑1、p62蛋白］水平。

另取18月龄BL/C57小鼠18只，按随机数字表法分为3组（每组6只）：七氟醚+3‑甲基腺嘌呤组（M组，吸入麻醉前2 h经腹腔注射3‑甲基腺嘌呤）、七氟醚+雷帕霉素组（R组，吸入麻醉前24 h和2 h经腹腔注射雷帕霉素）、七氟醚+生理盐水组（N组，吸入麻醉前2 h经腹腔注射生理盐水100 μl）。经腹腔注药及七氟醚处理后，尼氏染色检测海马神经元细胞凋亡情况，Western blot法检测海马神经元细胞自噬相关蛋白（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline‑1、p62蛋白）水平。 

2 结果     

2.1　七氟醚组和对照组小鼠新物体识别率及辨别系数比较

七氟醚组小鼠新物体识别率和辨别系数均低于对照组（t=4.01，P<0.001；t=2.93，P=0.011）。见图1。

2.2　七氟醚组和对照组小鼠海马神经元细胞凋亡比较

七氟醚组小鼠海马神经元细胞凋亡较对照组增加（t=3.63，P=0.002）。见图2。

2.3　七氟醚组和对照组小鼠海马细胞自噬相关蛋白水平比较

与对照组比较，七氟醚组小鼠海马细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline‑1水平升高（t=3.63，P<0.002；t=3.87，P<0.001），p62蛋白水平降低（t=3.43，P=0.004）。见图3。

2.4　N组、M组、R组小鼠海马神经元细胞凋亡比较

与N组比较，M组海马神经元细胞凋亡增加（t=3.05，P=0.015），R组海马神经元细胞凋亡降低（t=3.65，P=0.006）。见图4。

2.5　N组、M组、R组小鼠海马细胞自噬相关蛋白水平比较

与N组比较，M组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline‑1水平降低（t=4.95，P=0.005；t=12.75，P<0.001）、p62蛋白水平升高（t=4.71，P=0.002），R组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline‑1水平升高（t=2.86，P=0.034；t=3.71，P=0.003），p62蛋白水平降低（t=5.32，P=0.002）。见图5。

3 讨论     

在本研究中，我们发现老年小鼠2.5%七氟醚吸入3 h可致短期的学习记忆下降，与本课题组既往研究结果一致。我们推测老年动物较发育期更易发生七氟醚致认知障碍的原因可能在于：随着年龄的增加，大脑内神经再生率和突触发生率下降并出现潜在神经毒性物质的积聚，导致神经储备能力下降，因而对伤害的易感性增加。

本研究在老年小鼠七氟醚吸入麻醉后24 h取脑组织进行尼氏染色，结果提示七氟醚组小鼠海马存在神经元细胞丢失；神经元丢失则是神经系统疾病病理生理的关键环节之一。因而，我们认为老年小鼠七氟醚吸入后致海马神经元细胞凋亡是其出现早期学习记忆下降的原因之一。

本研究中，为验证细胞自噬在老年小鼠七氟醚吸入麻醉致认知功能障碍中的作用机制，分别经3‑甲基腺嘌呤抑制细胞自噬、雷帕霉素促进细胞自噬或生理盐水对照预处理，在七氟醚处理后再次检测海马区神经自噬及神经细胞凋亡情况，结果提示促进细胞自噬后可抑制七氟醚吸入麻醉后的海马神经细胞凋亡，而抑制细胞自噬则降低七氟醚所致神经细胞凋亡的伤害阈值，导致神经元的进一步丢失。该结论提示，老年小鼠在2.5%七氟醚吸入麻醉3 h的应激刺激中，均诱导了海马神经细胞的凋亡和细胞自噬，而细胞自噬的激活可负反馈抑制神经细胞的凋亡，提高机体的伤害性阈值。

本研究不足之处在于，在细胞自噬抑制剂和激活剂预处理后，经七氟醚吸入诱导后未再次评估老年小鼠的认知功能，从而进一步确定在促进细胞自噬后是否可以通过抑制细胞凋亡来改善老年小鼠的神经功能。