快报 | 吡嗪酰胺增强结核亚单位疫苗LT70诱导长期T细胞免疫记忆

作者：牛红霞，白春香，李菲，马澜，何娟娟，石新彤，韩雪，祝秉东，张颖

第一作者及单位：牛红霞，浙江中医药大学基础医学院病原生物与免疫教研室/兰州大学基础医学院病原生物学研究所

通信作者及单位：祝秉东教授，兰州大学基础医学院病原生物学研究所；张颖教授，浙江大学医学院第一附属医院

Pyrazinamide Enhances Persistence of T-cell Memory Induced by Tuberculosis Subunit Vaccine LT70

Niu H, Bai C, Li F, Ma L, He J, Shi X, Han X, Zhu B, Zhang Y.

Tuberculosis (Edinb)，2022，135:102220.

doi: 10.1016/j.tube.2022.102220. 

PMID: 35679762

研究背景

吡嗪酰胺（PZA）是一种治疗结核病的关键一线药物。与作用于生长细菌的普通抗生素相比，PZA仅对持留结核分枝杆菌有作用。由于PZA的结构与天然多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂烟酰胺（NAM）非常相似，我们推测PZA也可能是PARP抑制剂，并推测其对记忆T细胞的分化具有潜在的调控作用。 

此前，我们构建了由结核分枝杆菌生长期抗原（ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64 190-198肽）和结核分枝杆菌潜伏期抗原Rv2626c组成的多阶段亚单位疫苗LT70，该疫苗具有较强的免疫原性和抗结核分枝杆菌H37Rv的保护能力。为了验证上述假设，我们在体外评估了PZA对PARP酶活性的影响，并利用LT70疫苗来研究PZA治疗是否能增强小鼠疫苗特异性T细胞免疫记忆反应。

研究背景

1.免疫方案：周龄C57BL/6小鼠，于第0天、第14天和第28天分别皮下注射LT70疫苗。同时，用PZA（150 mg·kg-1·d-1）对小鼠灌胃处理53 d，具体时间如下：（1）疫苗免疫后T细胞扩张期：第1～8天、第14～22天、第28～36天；（2）疫苗免疫后T细胞收缩期：第36～54天。具体见下图。

图示  用PZA对注射LT70疫苗后的小鼠灌胃处理53 d的免疫方案

2.免疫检测：末次免疫后24周和28周进行免疫检测，主要检测记忆T细胞介导的免疫应答，具体如下：（1）流式细胞术检测脾脏抗原特异性CD4+T淋巴细胞中共表达IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞比例。（2）末次免疫后28周，流式细胞术和ELISA检测脾脏淋巴细胞在抗原刺激下，细胞因子IFN-γ和IL-2的产生水平。（3）EdU染色检测脾脏淋巴细胞的长期增殖能力。（4）抗原两次刺激后，流式细胞术检测脾细胞产生IFN-γ的CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞数目，间接反映长期免疫记忆反应。

研究结果

1.PZA对PARP酶活性的抑制作用：我们发现PZA确实对PARP有一定的抑制作用，5 μM时PARP的活性降低到70%，与NAM对照相似（图1A），当PZA浓度增加到10 μM时，PARP的活性下降到<20%。说明抑制活性与PZA剂量呈正相关（图1B）。

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图1  PZA对PARP酶活性的剂量效应关系。（A）吡嗪酰胺（PZA）和烟酰亚胺（NAM）的结构。（B）采用ELISA测定PZA对PARP酶的抑制作用

2.PZA对疫苗诱导的多功能CD4+ T淋巴细胞的数量影响不大：为了确定PZA是否会影响疫苗诱导的T细胞短期免疫记忆，我们通过检测抗原特异性CD4+T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力。我们观察到，免疫8周后，LT70-PZA免疫小鼠产生共表达细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的的T细胞比例略高于LT70单独免疫小鼠，但差异无统计学意义（图2）。结果发现，PZA处理并没有显著增加疫苗诱导的多功能性淋巴细胞的频率，表明PZA处理并没有改善多功能性记忆T细胞的形成。

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图2 共表达细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的Ag85B特异性CD4+ T淋巴细胞。A：CD4+T淋巴细胞受Ag85B刺激后IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌谱；B：IFN-γ、IL-2和TNF-α阳性CD4+T淋巴细胞频率

3.PZA增强了疫苗产生的长期T细胞免疫记忆反应：在第32周，末次免疫后28周，采用ELISA和流式细胞术检测抗原特异性IFN-γ和IL-2的产生水平。我们发现LT70 + PZA组小鼠脾脏细胞分泌的IL-2水平高于单独LT70组小鼠（P<0.05，图3A）。此外，LT70免疫组和PZA处理组小鼠的Ag85B特异性CD4+IL-2+淋巴细胞数量也均高于单独LT70免疫组（P值均<0.05，图3A）。而在IFN-γ分泌水平和CD4+IFN-γ+淋巴细胞数量方面，两组间无明显差异（P=0.07），图3B。结果表明，PZA处理增强了疫苗特异性的长期IL-2反应，而不是IFN-γ反应，这表明PZA有助于诱导中央记忆性T细胞。

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图3  PZA+LT70疫苗诱导的长期IFN-γ和IL-2反应。小鼠经LT70-PZA免疫，末次免疫后28周，采用ELISA和流式细胞术检测抗原Ag85B特异性IL-2和IFN-γ反应。（A）Ag85B特异性IL-2反应。（B）Ag85B特异性IFN-γ反应 

4.PZA可提高淋巴细胞的长期增殖能力：由于PZA可诱导疫苗特异性的中央记忆性T细胞，我们进一步验证了淋巴细胞的长期增殖能力。疫苗末次接种后28周，用蛋白抗原体外刺激分离的脾细胞3 d，以消耗具有短期增殖潜能的细胞（效应记忆T细胞，TEM）。然后用edu标记脾淋巴细胞，再用Ag85B刺激4 d。最后，对总淋巴细胞进行设门，通过FlowJo增殖算法读取EdU谱图并进行分析，建立增殖代数。经特异性抗原Ag85B刺激7 d后，我们观察到LT70 + PZA处理小鼠的增殖淋巴细胞数量比单独LT70接种小鼠和未接种小鼠的增殖淋巴细胞数量更多（图4）。结果表明，PZA提高了淋巴细胞的长期增殖能力，这也说明PZA有助于诱导疫苗特异性中央记忆性T细胞。

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图4 淋巴细胞长期增殖能力。第32周处死小鼠进行增殖实验，先用Ag85B（5 μg/ml）刺激淋巴细胞3 d，消耗具有短期增殖潜能的细胞（效应记忆T细胞，TEM）。然后将收获的细胞加入EdU，再用Ag85B刺激4 d。最后，利用FlowJo增殖算法对EdU配置文件进行分析，建立代数。（A）3只小鼠的代表性结果。（B）EdU+总淋巴细胞的频率

5.经抗原两次刺激后，PZA可提高产生IFN-γ的淋巴细胞 ：LT70免疫后28周，小鼠腹腔注射卡介苗（1×106 CFU），刺激疫苗特异性中央记忆性T细胞在体内分化为效应记忆T细胞或效应T细胞。感染9 d后，分离脾细胞，用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和PPD混合抗原体外刺激4 h，进行细胞内细胞因子和抗原特异性IFN-γ阳性T细胞数量的分析，以反映中央记忆性T细胞的质量和功能。结果显示，PZA处理小鼠的IFN-γ+淋巴细胞频率，尤其是CD4+IFN-γ+淋巴细胞频率均高于未处理小鼠（图5）。

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图5 抗原两次刺激后脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的水平（卡介苗体内刺激和蛋白抗原体外刺激）。（A）抗原两次刺激间接反映长期免疫记忆反应原理示意图。LT70疫苗免疫28周后，腹腔注射卡介苗（1×106 CFU）刺激小鼠。感染9 d后处死小鼠，用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c（各2 μg/ml）和PPD（4 μg/ml）混合抗原体外分离和刺激小鼠淋巴细胞。通过胞内细胞因子染色分析IFN-γ阳性淋巴细胞数量。（B）CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和总淋巴细胞两次刺激后IFN-γ分泌谱。（C）两次刺激产生IFN-γ的CD4+、CD8+T淋巴细胞和总淋巴细胞的频率

研究结论

研究结果表明，PZA联合疫苗促进了疫苗诱导的T细胞长期免疫记忆的产生，对开发新的结核病疫苗接种和治疗策略具有重要意义。 

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供稿：牛红霞

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-06-27