纳米抗体在抗击新冠中的研究进展

新冠疫情爆发至今已有两年有余，在抗击疫情的艰难道路上，科研人员坚持不懈地积极寻找各种有效方法，力争打赢这场攻坚战。

当大多数人对羊驼的印象还停留在会吐口水的“网络神兽”时，科研人员的目光已经注意到了它血液里的独特抗体——纳米抗体。

纳米抗体由于结构简单，分子量小，在冠状病毒的诊断与治疗中展现了广阔应用前景。当前主要采用基于噬菌体展示，酵母展示的免疫文库，天然文库，人源化合成文库与基于NGS测序&质谱等技术来筛选纳米抗体，然后将识别不同表位的纳米抗体进行组合，获得高病毒中和活性候选分子，以期用于临床开发。同时纳米抗体也被开发成雾化可吸入制剂，通过吸入途径有效递送至肺部，达到治疗新冠肺炎的目的。

纳米抗体在靶向SARS-CoV-2中的研究进展

在2020年3月份疫情爆发的初期，Cell刊登了首项针对SARS-CoV-2的纳米抗体相关研究成果。该项研究最初是为了研发出抗击SARS和MERS两种冠状病毒的中和纳米抗体，Wrapp等将SARS与MERS的S蛋白交替免疫羊驼，筛选出能同时中和这两种病毒的纳米抗体。在新冠疫情爆发后，序列比对发现Covid-19与SARS病毒的基因序列同源性非常高，于是通过初步筛选纳米抗体VHH-72显示出了中和新冠病毒的能力，不过比其与SARS，MERS的结合力要弱。

图2 MERS VHH-55和SARS VHH-72的表位测定及中和活性研究

2020年5月，Emerging Microbes & Infections 期刊发布了一项研究，Dong等研究人员从人源化合成VHH文库中成功筛选到SARS-CoV-2的中和纳米抗体。通过SARS-CoV-2的S蛋白结合实验，筛选出了69个可以与S蛋白结合的特异性纳米抗体，其中15个纳米抗体可以阻断S蛋白与ACE2受体结合；又通过构建不同的纳米抗体组合，提高了对S蛋白RBD的亲和力，并且可以有效抑制SARS-CoV-2的感染；此外将所获得的纳米抗体与人IgG-Fc融合后，发现可以提升抑制SARS-CoV-2感染细胞的作用。该项研究表明其所获得的纳米抗体可以被用于新冠病毒的诊断与治疗。

图3 抗SARS-CoV-2抗体发现的流程

同年9月，Hanke等在Nature Communications 发布了文章，采用SARS-CoV-2 S1-Fc 和RBD免疫羊驼，并分离出了一株高亲和力的纳米抗体——Ty1。病毒中和实验表明，纳米抗体Ty1中和SARS-CoV-2的IC50为54 nmol/L。纳米抗体Ty1可以特异靶向SARS-CoV-2 S-RBD蛋白，以高亲和力结合到S-RBD蛋白，直接阻断其与ACE2结合，起到了封闭ACE2的作用。Hanke等还发现将纳米抗体Ty1与经典抗体的Fc结合，IC50降低至12 nmol/L，可有效抑制SARS-CoV-2的感染。

图4 纳米抗体发现与Ty1序列

在2020年11月，Schoof等在Science发布了一项关于中和SARS-CoV-2的多价纳米抗体的研究，并且将中和抗体制成了气溶胶形式，为吸入式治疗提供了可能。Schoof等从合成酵母文库中分离出了21株对SARS-CoV-2的S蛋白不同表位具有高亲和力的纳米抗体，其中部分纳米抗体可以与S-RBD蛋白结合，可阻断SARS-CoV-2与ACE2结合。同时，Schoof等以二价和三价形式设计了Nb6的衍生纳米抗体，其中三价的Nb6的IC50为1.2 nmol/L，显著提高了对SARS-CoV-2的抑制作用。在雾化、冻干和热处理后，三价Nb6活性未受到影响，使得气溶胶介导的纳米抗体中和制剂可以直接传递到呼吸道上皮细胞，为新冠病毒吸入式治疗提供了可能。2021年12月在EMBO期刊上，Wagner等针对SARS-CoV-2变体(β、δ)，对实验小鼠进行纳米抗体吸入式给药治疗，证明了针对新冠病毒进行吸入式治疗的可行性及有效性。

图5 抗体开发流程，亲和力检测与表位分析

2020年12月18日，时毅团队在Science杂志上发表了题为“Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2”的研究论文，文中介绍了他们采用NGS测序与质谱联用的方法，从羊驼体内快速发现了8000多个高亲和力的抗SARS-CoV-2纳米抗体，其中Nb21亲和力低于1pM。通过设计，将Nb21做成三聚体的形式，以此进一步增强其抗病毒活性。在与雾化专家Doug Reed博士的合作下，研究人员开发了这种纳米抗体的可吸入式雾化剂，将其命名为Pittsburgh Inhalable Nanobody-21（PiN-21），是迄今已鉴定出的最有效的抗新冠病毒纳米抗体。在仓鼠实验中，这种喷雾剂可以治疗新冠病毒感染引起的重症。

图6 基于NGS测序与质谱分析的纳米抗体开发流程

近期的新冠病毒奥密克戎变异株(Omicron)在全球范围内大肆传播，奥密克戎变异株在病毒S蛋白中具有30多个突变，在S-RBD蛋白中具有15个突变，这是中和抗体的主要作用位点。与仅具有不超过三个S-RBD蛋白突变的其他新冠病毒变体不同，奥密克戎变异株这一突变对疫苗和治疗性抗体的保护功效提出了挑战。

复旦大学应天雷教授课题组、吴艳玲副研究员课题组以及孙蕾研究员课题组合作在Cell期刊上发表了一项关于新冠病毒奥密克戎变异株中和纳米抗体研究成果。该项研究鉴定出两株具有广谱中和活性的全人源纳米抗体（n3113v与n3130v），它们可以有效地结合Omicron变体 RBD上的高度保守区域。将这两株全人源纳米抗体串联，获得全人源纳米双抗bn03，能高效地中和包括奥密克戎病毒在内的各种新冠病毒流行变异株。动物实验证明这种双特异性抗体可以通过吸入给药有效地输送到肺部，并在 SARS-CoV-2 感染的小鼠模型中表现出出色的治疗效果。

图7 实验流程

Titong等利用计算机辅助设计，开发了基于抗SARS-CoV-2 VHHs的双特异性和三特异性抗体，靶向串联排列的多个表位，并与人IgG1 Fc结构域融合。这种设计可以抵抗新出现的新冠病毒的突变体，并具有多种作用机制。重要的是，通过计算机辅助设计，能够优化抗体，提高安全性、有效性和可制造性。体外表征证明了多特异性抗体的活性，尤其是三特异性抗体，与双特异性抗体和联合使用的单克隆抗体相比，在S蛋白结合能力和S/ACE-2信号阻断方面更有效。此外，与单克隆抗体鸡尾酒相比，三特异性抗体能更好地阻断SARS-CoV-2假病毒感染人体细胞。

该团队还评估了ABS-VIR-001（来源于VHH，以其天然热稳定性而闻名）对与新冠病毒大流行关键变体相关的突变体中和能力，包括α、β、Delta、Lambda和Omicron。结果表明ABS-VIR-001由于多表位设计可以有效中和新冠病毒大流行关键变体，其可以进一步开发为针对SARS-CoV-2和新出现的病毒变体的临床防治药物。

图8 ABS-VIR-001可预防huACE-2小鼠中的SARS-CoV-2假病毒感染。

✎ 结 语  

纳米抗体由于分子量小、理化性质稳定，能够非常有效的通过雾化方式迅速递送到呼吸道、肺泡等新冠感染的病灶部位，小鼠模型发现雾化的纳米抗体在轻症和重症新冠感染小鼠模型中均能够有效的抑制病毒感染，证实了纳米抗体的有效性和临床潜力。但是尽管研究者迫切希望纳米抗体最终能用于新冠病毒的预防与治疗，仍然还需要很多的研究，且需要通过临床实验。纳米抗体作为一种新型抗体，如何将纳米抗体的基础研究成果转化为应用产品，逐步走向临床，在更多传染病的诊疗中发挥更大作用，需要未来研究者们共同的努力。

????参考资料：

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