【论肿道麻】咪达唑仑在小鼠胰腺导管腺癌模型中显示出抗肿瘤和抗炎作用

手术切除原发肿瘤通常是癌症患者的首选治疗方法，尽管最近的研究表明，围手术期管理影响癌症患者的长期预后。然而，咪达唑仑对胰腺导管腺癌的影响尚不清楚。2022年4月，Yukino Oshima等人在《British Journal of Anaesthesia》杂志上发表了一篇题为《Midazolam exhibits antitumour and anti-inflammatory effects in a mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma》的文章，评估了咪达唑仑对‍LSL-KrasG12D/+;Trp53flox/flox;Pdx-1cre/+转基因胰腺导管腺癌小鼠的抗肿瘤、抗炎和镇痛作用。现介绍如下：

背景

咪达唑仑(MDZ)是一种苯二氮卓类麻醉药，广泛应用于全麻诱导、麻醉前用药、术中和术后镇静。MDZ的主要临床作用是通过神经元γ-氨基丁酸A型受体内的中枢苯二氮卓受体介导的，而MDZ通过外周苯二氮卓受体(PBRs)对肺癌和胶质瘤细胞具有抗肿瘤作用。PBRs（即易位蛋白(TSPO)）的过表达，在包括胰腺癌在内的各种癌症中均可检测到。然而，MDZ对胰腺导管腺癌(PDAC)的影响尚不清楚。作者假设MDZ在PDAC小鼠模型中具有抗肿瘤、抗炎和镇痛作用。使用转基因PDAC小鼠模型(LSL-KrasG12D/+;Trp53flox/flox;Pdx-1cre/+[KPPC])来评估MDZ对PDAC、肿瘤相关炎症细胞和癌相关疼痛的影响。

方法

将LSL-KrasG12D/+;Trp53flox/flox;Pdx-1cre/+小鼠（先天免疫炎症条件下自发形成的PDAC小鼠模型）分为三组。①6周龄KPPC小鼠给予MDZ 30mg/kg/d p.o.(既不产生镇静，也不发生低氧血症；n=13)或②载体(水；n=14)，直至人道终点(当小鼠没有表现出任何活动，包括梳理、每日食物摄入量＜1g/d、或体重在几天内减轻＞20%)；③6周龄KPPC小鼠腹腔注射PK11195(TSPO配体)3mg/kg/d，每周6次，加上MDZ 30mg/kg/d p.o.(n=10)直至人道终点。Cre-阴性对照小鼠取自同窝小鼠。

癌症相关疼痛用驼背评分和小鼠疼痛面部表情量表进行评估。两名对分组不知情的研究人员使用驼背评分来评估癌症相关的疼痛，包括探索行为(0-4分)和小鼠面部疼痛表情量表(MGS)(各0-2分；总分10分)。  

组织病理学测定肿瘤分期和免疫炎症状态。用小鼠胰腺导管腺癌细胞系研究咪达唑仑的抗增殖和凋亡潜能。  

结果

咪达唑仑在体内通过下调细胞周期蛋白抑制肿瘤增殖     

为了确定MDZ在体内对胰腺癌的影响，分别用MDZ、MDZ和PK11195 (MDZ+PK11195)或水载体对6周龄KPPC小鼠进行治疗(图1a)。在三个KPPC组中均检测到实性胰腺肿瘤结节(图1b)。与水载体治疗小鼠相比，MDZ治疗小鼠的肿瘤大小和直接侵犯周围组织/器官（而不是远处转移）的频率均降低，PK11195治疗逆转了MDZ引起的肿瘤缩小(图1c )。与水载体治疗的KPPC小鼠（30.5%）相比，MDZ治疗的KPPC小鼠（16.5%）上皮细胞K-19+PDAC成分的增殖Ki-67标记指数显著降低（图1d和e）。相反，与单独使用MDZ治疗相比，使用MDZ+PK11195治疗后PDAC中MDZ治疗组降低的Ki-67标记指数显著升高(32.5%)。MDZ治疗后，PDAC组分中细胞周期蛋白D1、A2和B1的含量降低，而PK11195可拮抗MDZ的抑制作用(图1d和e)。用MDZ(平均生存时间63.5天)、MDZ+PK11195(62.7天)和水载体(61.1天)治疗的三组KPPC小鼠之间的生存期无显著差异。

图1 MDZ抑制KPPC小鼠胰腺导管腺癌增殖  

咪达唑仑抑制局部炎性细胞浸润

作者测定了MDZ对PDAC免疫炎症微环境的影响。在MDZ治疗的KPPC小鼠中，与癌症进展相关的髓过氧化物酶+(MPO+)TANs的局部浸润减少(图2a和b)。相反，与单独使用MDZ相比，使用MDZ+PK11195时MPO+ TANs有所增加。诱导型一氧化氮合酶+抗肿瘤M1样TAMs在三组间无显著性差异。同时，MDZ和MDZ+PK11195治疗可减少精氨酸酶-1+促炎M2样TAMs。各组间细胞毒性CD8+T细胞差异无统计学意义。

作者研究了局部髓源性抑制细胞，因为它们促进PDAC的进展，并与临床上不良预后相关。 咪达唑仑抑制KPPC小鼠中CD11b+Ly-6G+多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSCs)的局部浸润(图2c和d)，而MDZ+PK11195则使PMN-MDSCs局部浸润增加。与胰腺肿瘤的结果相似，MDZ使骨髓中的MPO+粒细胞系减少，而这种减少被MDZ+PK11195拮抗。 

图2 咪达唑仑对KPPC小鼠炎性细胞浸润的抑制作用  

作者研究了MDZ对肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)增殖和肿瘤血管生成的促纤维增生反应的影响。Masson三色染色显示，水载体治疗的KPPC小鼠的PDAC周围可见蓝色增厚的胶原纤维(图3a)，而MDZ和MDZ+PK11195治疗的小鼠的PDAC巢周围可见薄纤维。与Masson三色染色的结果相似，与水载体治疗小鼠相比，MDZ或MDZ+PK11195治疗后，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)+CAFs显著减少(图3a和b)。作者观察到三组间CD31+肿瘤血管的数量没有差异。而MDZ +PK11195治疗的小鼠CD31+微血管密度增加。

图3 咪达唑仑治疗使α-SMA+癌相关成纤维细胞减少  

咪达唑仑可减轻KPPC小鼠的疼痛症状和减少炎性细胞因子 

作者研究了MDZ对KPPC小鼠癌相关疼痛的影响，这些小鼠表现出疼痛的迹象，包括严重的圆背姿势(图4a)。MDZ治疗的KPPC小鼠表现出轻微的圆背姿势，而MDZ+PK11195组小鼠的圆背姿势有所进展。与水载体治疗小鼠相比，MDZ治疗的小鼠在死前0-26天（pmd）内的驼背评分显著下降(图4b）。同样，MDZ治疗的KPPC小鼠在0-21pmd内MGS评分较水载体治疗的小鼠有所提高(图4c）。MDZ对驼背和MGS评分的影响被MDZ+PK11195逆转。对照组小鼠在观察期间，驼背和MGS评分保持较低。  

为阐明MDZ在KPPC模型中缓解疼痛的机制，作者研究了血浆细胞因子的浓度(图4d)。使用混合血浆的细胞因子抗体芯片显示，与对照组小鼠相比，KPPC小鼠主要的疼痛相关细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6和IL-1α升高(图4d)。这些细胞因子在MDZ治疗的小鼠中降低，而与MDZ治疗的小鼠相比，MDZ+PK11195治疗的小鼠IL-1α和IL-6升高。作者分析了TAN和MDSC相关细胞因子的血药浓度。MDZ，而非MDZ+PK11195，减少了TANs和PMN-MDSCs的局部浸润。与骨髓粒细胞分化密切相关的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-3和IL-6经MDZ治疗后减少，MDZ+PK11195治疗可以拮抗这种减少。MDZ还能降低TNF-α、IL-17、C-X-C基序配体(CXCL)1、CXCL5和干扰素γ，增强TAN的募集和激活，以及TAN衍生的细胞因子CXCL1、CC趋化因子配体(CCL)3和CCL5，而MDZ+PK11195治疗的小鼠这些细胞因子增加。此外，与MDZ单独治疗的小鼠相比，MDZ+PK11195治疗组小鼠脊髓背角和周围神经系统慢性疼痛相关的CCL2、CCL3、CCL21和CXCL13增加。

图4 咪达唑仑对炎症细胞因子和癌相关性疼痛的调节作用  

咪达唑仑抑制PDAC细胞株增殖

在体外，MDZ或PK11195的存在抑制了PDAC衍生细胞株的增殖(图5a)。为了解MDZ的抗增殖机制，作者测定了细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的表达。咪达唑仑和PK11195抑制小鼠PDAC细胞系中细胞周期蛋白B1的浓度(图5b和c)。在一个PDAC细胞系(147)中，MDZ和PK11195抑制细胞周期蛋白D1和A2的表达，但在其他细胞系(146和244)中效果不确定。咪达唑仑降低CDK1和CDK4在三种PDAC细胞系中的表达，而MDZ降低CDK2在一个PDAC细胞系(244)中的表达。流式细胞仪分析显示，MDZ在小鼠PDAC细胞系(146和147)中诱导G2/M阻滞，而G0/G1阻滞在一个细胞系(244)中增加。咪达唑仑对早期凋亡细胞的诱导作用轻微，对晚期凋亡/坏死细胞的诱导作用更明显。胰腺星状细胞(PSCs)是活化的α-SMA+ CAFs的来源，其增殖在体外被MDZ以浓度依赖性的方式抑制(图5d)。 

图5 咪达唑仑对小鼠PDAC和人胰腺星状细胞系的抗增殖作用  

讨论

基因工程小鼠模型保持了固有的免疫炎症系统，比使用免疫缺陷小鼠的移植模型能更准确地模拟癌症，为了探讨MDZ不仅对PDAC细胞，而且对基质细胞(包括CAFs和免疫炎症细胞)的影响，作者采用KPPC遗传模型。图6a总结了肿瘤-基质微环境的变化。

图6 咪达唑仑对胰腺导管腺癌小鼠模型影响的示意图  

作者发现MDZ可下调PDAC细胞周期蛋白/CDKs和细胞周期停滞，并诱导细胞死亡。以往的报道表明，MDZ可诱导非PDAC细胞系细胞周期蛋白D和A的下调，导致G0/G1阻滞和细胞凋亡。诱导非凋亡细胞死亡可由PDAC细胞系中p53-异敲除引起。尽管最近的研究表明，MDZ不仅调节细胞周期，还调节线粒体半胱天冬酶通路、内质网应激和自噬，以诱导细胞凋亡，但下调细胞周期蛋白/CDKs、连续细胞周期阻滞、诱导凋亡和非凋亡细胞死亡可能是MDZ在PDAC细胞中的关键机制。  

PK11195对增殖的抑制作用可能是外周TSPO的激动剂而非拮抗剂。在体内和体外，PK11195在胶质母细胞瘤细胞系中表现出抗增殖和促凋亡反应。在体外，作者发现MDZ和PK11195对PDAC和PSC系具有抗增殖潜力。胰腺导管腺癌细胞和PSCs/CAFs分泌多种细胞因子，并相互激发增殖潜能。尽管如此，MDZ+PK11195治疗的小鼠PDAC的增殖增加，说明PK11195增加的增殖潜能并不是由PDAC和CAF介导的因素所致。                                                  

肿瘤相关炎症细胞在PDAC的发生发展中起重要作用。之前的报道显示，MDZ抑制非癌性病变中性粒细胞和巨噬细胞的活化，而PK11195则拮抗这些功能。同样，作者观察到MDZ抑制TANs、M2样TAMs和PMN-MDSCs的局部浸润。通过免疫组化很难区分抗肿瘤N1和促肿瘤N2 TANs，但该研究结果提示，MDZ可能抑制了N2 TANs的功能。此外，在活化内皮细胞上表达并与白细胞-内皮相互作用有关的可溶性血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1和P-选择素的减少，也可能减少白细胞从血管向局部病变的迁移。  

由PDAC、CAFs和炎症细胞分泌的炎性细胞因子参与了炎性疼痛的发生机制。MDZ参与炎症细胞及相关细胞因子的情况见图6b。作者观察到MDZ减少炎性细胞因子，包括IL-6。最近的一项研究表明PSC/CAF来源的IL-6能促进外周血单核细胞来源的髓源性抑制细胞的分化和扩增。在荷瘤小鼠中，髓源性抑制细胞是IL-6的来源，而在KRAS诱导的PDAC小鼠模型中，IL-6的缺失显示肿瘤内髓源性抑制细胞减少。髓源性抑制细胞的募集和扩增是由许多炎症因子介导的，如IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF、CCL2和CCL5。在胰腺癌模型小鼠中，MDZ降低了这些细胞因子。CCL5的升高可促进骨癌转移中的炎症和伤害性疼痛。髓源性抑制细胞的CCL5/CCR5轴在其募集和活化过程中起重要作用。尽管直接机制尚不清楚，但MDZ抑制髓源性抑制细胞的局部浸润可通过抑制IL-6和CCL5浓度来改善炎性疼痛。  

每日腹腔注射PK11195不能排除疼痛症状加重的可能。事实上，PK11195通过增加血浆趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL21、CXCL1和CXCL13，可能通过脊髓背角和外周神经系统增强炎性疼痛。

总之，咪达唑仑抑制胰腺导管腺癌和癌相关成纤维细胞的增殖，抑制肿瘤相关中性粒细胞、M2样肿瘤相关巨噬细胞和多形核髓源性抑制细胞的局部浸润，从而抑制胰腺导管腺癌的进展。

“论肿道麻”述评

一些报道表明麻醉药物，包括氯胺酮、异丙酚和吗啡对免疫系统有抑制作用。的确，麻醉药物，如右美托咪定，可以增强癌症的增殖、侵袭和转移。因此，选择合适的麻醉药物对癌症患者手术至关重要。与其他恶性肿瘤相比，胰腺导管腺癌有较高的死亡率。由于术前新辅助化疗的发展，胰腺癌患者手术切除的频率越来越高。正在接受手术的可切除的PDAC患者需要麻醉药物进行术前和术后管理，而不能切除的PDAC患者也需要适当的护理，包括抑制癌症相关的疼痛。咪达唑仑在非癌症发病机制中抑制巨噬细胞和中性粒细胞功能。促炎性M2肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤相关中性粒细胞(TANs)的浸润与癌症进展以及癌症相关的炎性疼痛有关。研究MDZ对围手术期干预后的复发和无病生存等长期结局的影响是很重要的，但包括手术切除肿瘤在内的手术永远不会只用MDZ进行管理。仅仅研究MDZ的作用是有局限性的，但该研究的发现为麻醉医生和PDAC患者提供了有用的信息。这些临床前研究结果为进一步研究咪达唑仑和其他围手术期药物对癌症相关干预后的复发和无病生存等长期结局的影响提供了基础。

编译：吕晓彬；述评：周国霞

审核：张军，缪长虹 

参考文献：   Midazolam exhibits antitumour and anti-inflammatory effects in a mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. Oshima Y, Sano M, Kajiwara I, et al. Br J Anaesth. 2022 Apr;128(4):679-690. doi: 10.1016/j.bja.2021.12.042. Epub 2022 Apr 1.  

声明：古麻今醉公众号为舒医汇旗下，古麻今醉公众号所发表内容之知识产权为舒医汇及主办方、原作者等相关权利人所有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制、裁切、录制等。经许可授权使用，亦须注明来源。欢迎转发、分享。  

打赏